緱麗莎，鄭貝貝，齊亞丹，張翼

(周口市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，河南 周口466000)

糖尿病是一種糖、蛋白質(zhì)、脂肪等代謝紊亂的慢性疾病，糖尿病主要是由于機(jī)體內(nèi)的胰島素不足引起的，β細(xì)胞是一種內(nèi)分泌細(xì)胞，其具有分泌胰島素的作用，胰島β細(xì)胞分泌胰島素主要受到血糖的影響[1,2]。研究表明，胰島β細(xì)胞過(guò)度凋亡引起的胰島β細(xì)胞功能異常是糖尿病胰島β細(xì)胞損傷發(fā)生的重要原因之一，探討高糖環(huán)境下胰島β細(xì)胞損傷機(jī)制對(duì)于研究糖尿病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義[3]。程序性細(xì)胞死亡4(programmde cell death 4,PDCD4)是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，其參與調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯、基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，在細(xì)胞程序性死亡過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用[4]。近年來(lái)的研究顯示，PDCD4參與糖尿病發(fā)生過(guò)程，與高糖環(huán)境下的心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞損傷發(fā)生有關(guān)[5-7]。本研究通過(guò)下調(diào)胰島β細(xì)胞中PDCD4的表達(dá)水平，探討敲低PDCD4在高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞損傷中的作用，為明確糖尿病胰島β細(xì)胞損傷機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 胰島β細(xì)胞INS-1購(gòu)自武漢普諾賽(Procell)生命科技有限公司;PDCD4 siRNA重組慢病毒、陰性對(duì)照慢病毒由吉滿生物科技(上海)有限公司構(gòu)建；GAPDH、PDCD4引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；Realtime PCR試劑盒(SYBR Green)購(gòu)自上海索寶生物科技有限公司；丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶 (Superoxide Orgotein Dismutase,SOD)含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司；胰島素含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京利維寧生物科技有限公司；活化型Caspase-3(Cleaved Caspase-3)抗體購(gòu)自美國(guó)CTS。

1.2 慢病毒感染和分組 INS-1細(xì)胞接種到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞密度為35%左右時(shí)，取慢病毒液，添加到細(xì)胞中，感染復(fù)數(shù)為10，同時(shí)添加Polybrene(終濃度為 6mg/L)，放在 37℃，5%CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜，將病毒液吸棄，加入完全培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞融合度為90%，觀察綠色熒光表達(dá)情況，感染效率高于90%。分別取穩(wěn)定感染PDCD4 siRNA重組慢病毒、陰性對(duì)照慢病毒的INS-1細(xì)胞用含有25mmol/L葡萄糖的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)依次記為干擾組、陰性對(duì)照組，同時(shí)取沒(méi)有感染慢病毒的INS-1細(xì)胞用含有25mmol/L葡萄糖的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)記為高糖組，沒(méi)有感染慢病毒的INS-1細(xì)胞用含有5.5mmol/L葡萄糖的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)記為對(duì)照組。以Realtime PCR和Western blot檢測(cè)高糖組、陰性對(duì)照組、干擾組細(xì)胞中PDCD4的表達(dá)變化，確定PDCD4 siRNA對(duì)高糖條件下INS-1細(xì)胞中PDCD4敲低效果。

1.3 Realtime PCR檢測(cè)PDCD4表達(dá)變化 高糖組、陰性對(duì)照組、干擾組細(xì)胞培養(yǎng)48h以后，用Trizol試劑提取各組胰島β細(xì)胞中的總RNA，取1μg的RNA樣品，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，根據(jù)Realtime PCR試劑盒(SYBR Green)檢測(cè)PDCD4表達(dá)變化。PDCD4引物：上游5，-CCAAAGAAAGGTGGTGCA-3’，下游 5，-TGAGGTACTTCCAGTTCC-3’。 內(nèi)參 GAPDH引物： 上游：5，-CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3’， 下游 5，-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3’。根據(jù)每個(gè)樣本反應(yīng)的Ct值，得到△Ct，根據(jù)2-△△Ct方法計(jì)算PDCD4表達(dá)變化。

1.4 Western blot檢測(cè)PDCD4表達(dá)變化 高糖組、陰性對(duì)照組、干擾組細(xì)胞培養(yǎng)48h以后，添加細(xì)胞裂解溶液，冰浴40min后，在4℃，12000g離心10min，吸取上清(即蛋白溶液)，用BCA方法檢測(cè)蛋白濃度以后，添加Loading Buffer混合，置于沸水中煮5min后，添加至蛋白凝膠上樣孔內(nèi)，每個(gè)孔內(nèi)的蛋白量為30μg，接入電源，50V電壓觀察藍(lán)色條帶進(jìn)入到分離膠和濃縮膠的交接處以后，把電壓調(diào)整為120V，等到藍(lán)色條帶跑出分離膠時(shí)，終止電泳。在300mA電流條件下將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為100min，PVDF膜置于含有封閉液(5%牛血清白蛋白)的平皿內(nèi)，放在室溫反應(yīng)2h。把PVDF膜放在抗體孵育袋中，以1mL/cm2添加 PDCD4 抗體(1：600)，封口，放在 4℃中過(guò)夜，同樣的方法與二抗反應(yīng)后，化學(xué)發(fā)光，用Vision Workers LS分析光密度值，內(nèi)參為GAPDH。

1.5 CCK8檢測(cè)增殖變化 INS-1細(xì)胞按照105個(gè)/mL細(xì)胞密度接種到96孔板內(nèi)，按照對(duì)照組、高糖組、陰性對(duì)照組、干擾組分組方法處理細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，在每孔中添加CCK8工作液10μL，繼續(xù)孵育4h后，調(diào)整酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為450nm，以不含細(xì)胞的孔調(diào)零以后，測(cè)定每孔的OD值，把對(duì)照組細(xì)胞存活率設(shè)置為100%，分析高糖組、陰性對(duì)照組、干擾組細(xì)胞存活率變化。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡變化 按照對(duì)照組、高糖組、陰性對(duì)照組、干擾組分組方法處理細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，用PBS將細(xì)胞懸浮，4℃離心后，棄上清，添加300μL的結(jié)合緩沖液，再加入PI和Annexin VFITC染色以后，繼續(xù)加入200μL的結(jié)合緩沖液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化。

1.7 Western blot檢測(cè)Cleaved Caspase-3蛋白水平變化 按照對(duì)照組、高糖組、陰性對(duì)照組、干擾組分組方法處理細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平，步驟同1.4。

1.8 細(xì)胞中MDA、SOD水平檢測(cè) 按照對(duì)照組、高糖組、陰性對(duì)照組、干擾組分組方法處理細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，用黃嘌呤氧化法檢測(cè)細(xì)胞中SOD活性，硫代巴比妥酸法檢測(cè)細(xì)胞中MDA含量，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.9 細(xì)胞分泌胰島素水平檢測(cè) 按照對(duì)照組、高糖組、陰性對(duì)照組、干擾組分組方法處理細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，吸取培養(yǎng)液上清用ELISA法檢測(cè)胰島素水平，步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS21.0軟件分析，數(shù)據(jù)按照均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(meanSD)表示，多組差異比較采用單因素方差分析，組間比較用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDCD4 siRNA降低高糖環(huán)境下胰島β細(xì)胞中PDCD4表達(dá)水平 PDCD4 siRNA可以明顯下調(diào)高糖環(huán)境下胰島β細(xì)胞中PDCD4 mRNA和蛋白水平，構(gòu)建了高糖條件下敲低PDCD4表達(dá)的胰島β細(xì)胞。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 Western blot檢測(cè)PDCD4 siRNA對(duì)高糖環(huán)境下胰島β細(xì)胞中PDCD4表達(dá)影響

表1 PDCD4 siRNA對(duì)高糖環(huán)境下胰島β細(xì)胞中PDCD4表達(dá)影響(meanSD)

2.2 敲低PDCD4提高高糖條件下胰島β細(xì)胞增殖活性并減少細(xì)胞凋亡 高糖條件下胰島β細(xì)胞的存活率降低，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平升高。敲低PDCD4后的胰島β細(xì)胞經(jīng)過(guò)高糖處理后，細(xì)胞的存活率升高，細(xì)胞凋亡率降低，細(xì)胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平下降。敲低PDCD4可以逆轉(zhuǎn)高糖對(duì)胰島β細(xì)胞增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用。見(jiàn)圖2、表2。

2.3 敲低PDCD4降低高糖條件下胰島β細(xì)胞氧化損傷 高糖條件下胰島β細(xì)胞中MDA含量升高，SOD活性降低。敲低PDCD4后的胰島β細(xì)胞經(jīng)過(guò)高糖處理后，細(xì)胞中MDA含量減少，細(xì)胞中SOD活性升高。敲低PDCD4可以提高高糖環(huán)境下胰島β細(xì)胞抗氧化酶活性，減少細(xì)胞氧化損傷。見(jiàn)表3。

圖2 敲低PDCD4對(duì)高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡的影響

表2 敲低PDCD4對(duì)高糖環(huán)境下胰島β細(xì)胞增殖凋亡影響(meanSD)

表3 敲低PDCD4對(duì)高糖環(huán)境下胰島β細(xì)胞中MDA、SOD水平影響(meanSD)

2.4 敲低PDCD4提高高糖條件下胰島β細(xì)胞分泌胰島素水平 高糖條件下胰島β細(xì)胞分泌的胰島素水平降低。敲低PDCD4后的胰島β細(xì)胞經(jīng)過(guò)高糖處理后，細(xì)胞分泌的胰島素水平升高。敲低PDCD4可以提高高糖環(huán)境下胰島β細(xì)胞分泌胰島素水平。見(jiàn)表4。

3 討論

胰島β細(xì)胞異常是糖尿病發(fā)生的直接原因，胰島β細(xì)胞數(shù)量急劇減少導(dǎo)致細(xì)胞分泌的胰島素不足，進(jìn)而誘發(fā)蛋白質(zhì)、糖等物質(zhì)代謝紊亂[8]。氨基酸、激素、高血糖等都是誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞功能異常的誘發(fā)因子，其中高血糖是最為重要的誘導(dǎo)因子[9,10]。高血糖誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡和胰島素分泌減少[11]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，高糖處理后的胰島β細(xì)胞增殖活性降低，細(xì)胞凋亡增多，細(xì)胞分泌的胰島素減少，提示成功構(gòu)建了糖尿病胰島β細(xì)胞體外損傷模型。

表4 敲低PDCD4對(duì)高糖環(huán)境下胰島β細(xì)胞分泌胰島素水平影響(meanSD)

本次實(shí)驗(yàn)研究用PDCD4 siRNA下調(diào)胰島β細(xì)胞中PDCD4的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖能力升高，細(xì)胞凋率降低，敲低PDCD4具有少高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡的作用，這可能提示，PDCD4在糖尿病胰島β細(xì)胞損傷中發(fā)揮促進(jìn)作用。PDCD4是在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的凋亡相關(guān)基因，后續(xù)在人類及大鼠等生命體內(nèi)發(fā)現(xiàn)PDCD4的存在，人類PDCD4基因定位在10q24染色體上，其編碼的蛋白質(zhì)由469個(gè)氨基酸組成，其氨基側(cè)含有一個(gè)MA3結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域參與真核細(xì)胞翻譯起始因子的激活過(guò)程，具有抑制核糖體復(fù)合物及蛋白合成的作用，PDCD4蛋白的氨基和羧基的末端含有核定位信號(hào)和核輸出信號(hào)，另外，PDCD4蛋白還含有多個(gè)蛋白激酶的磷酸化位點(diǎn)，PDCD4的這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了其具有多種生物學(xué)功能，參與細(xì)胞生長(zhǎng)凋亡過(guò)程[12-14]。PDCD4具有促細(xì)胞凋亡、促進(jìn)氧化應(yīng)激等作用，不僅參與正常細(xì)胞生理功能發(fā)生，還參與病理狀態(tài)下細(xì)胞損傷過(guò)程，PDCD4在動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤、糖尿病、肥胖等疾病中均發(fā)揮關(guān)鍵作用，PDCD4基因缺失的小鼠經(jīng)高脂飼喂后，小鼠發(fā)生肥胖的數(shù)量明顯降低，PDCD4還參與高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞損傷發(fā)生，還有研究顯示，敲低PDCD4的表達(dá)可以抑制糖尿病條件下胰島β細(xì)胞的缺失，敲低PDCD4可能具有保護(hù)胰島β細(xì)胞的作用[15-18]。上述實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道同我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明敲低PDCD4具有抑制糖尿病胰島β細(xì)胞損傷的作用。

高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞損傷與氧化應(yīng)激等有關(guān)，SOD是細(xì)胞內(nèi)氧自由基清除的抗氧化酶，MDA是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化的產(chǎn)物，SOD活性降低導(dǎo)致氧自由基大量積累誘導(dǎo)氧化損傷[19]。另外，細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的氧自由基能夠誘導(dǎo)Caspase凋亡反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡發(fā)生，Caspase-3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行因子，其活化后可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生[20,21]。PDCD4表達(dá)水平的高低與細(xì)胞抗氧化能力、細(xì)胞凋亡水平等密切相關(guān)[22]。本實(shí)驗(yàn)表明，敲低PDCD4可以提高高糖環(huán)境下胰島β細(xì)胞中SOD活性，降低細(xì)胞中MDA水平，減少細(xì)胞凋亡，提示敲低PDCD4具有抑制高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的作用。

總之，敲低PDCD4對(duì)高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞功能損傷具有保護(hù)作用，其可能通過(guò)減少氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素，這為研究糖尿病條件下胰島β細(xì)胞損傷機(jī)制提供了參考。目前對(duì)于其具體的作用機(jī)制尚不明確，在以后的研究中會(huì)進(jìn)行探討。