喻景奕，周公社

(周口市中心醫(yī)院骨科，河南 周口466000)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯穆匀碜陨砻庖咝约膊1]。RA的發(fā)病機制復(fù)雜，目前認為RA是一種自身免疫性疾病。研究顯示，T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和促炎因子的分泌在RA的發(fā)生與進展中發(fā)揮了重要作用[2]。micro RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼RNA，其生物學(xué)功能廣泛，包括凋亡、細胞分化、代謝、病毒防御等[3]。目前已有針對 RA發(fā)生、發(fā)展中miRNA變化的研究，其中miRNA-149與RA關(guān)系密切。本研究探討微小RNA-149(MiR-149)rs22928323位點基因多態(tài)性與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)發(fā)病的關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取確診的RA患者90例(RA組)、健康自愿者90例(健康組)，收集時間2014年1月-2016年12月。RA組，男14例、女76例，年齡42～78歲，平均55.9±11.6歲。健康組，男18例、女72例，年齡38～79歲，平均56.1±12.4歲。兩組患者的年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)。

1.2納入排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)RA患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷及治療指南[4]；(2)患者血清類風(fēng)濕關(guān)節(jié)因子(RF)陽性；(3)手腕及關(guān)節(jié)X線片檢查確診；(4)對照組來源于門診體檢的健康自愿者；(5)獲得研究對象的知情同意及醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)伴有嚴重感染；(2)腫瘤疾?。?3)伴有免疫功能缺陷、低下；(4)近1個月使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制；(5)伴有嚴重的肝腎功能障礙。

1.3 基因檢測方法 抽取患者和健康自愿者外周靜脈血2ml，置于EDTA抗凝管中，采用 Trizol試劑盒(購自美國 Invitrogen公司)提取血清總 RNA，方法按照試劑盒說明書進行。使用PCR－RFLP分析技術(shù)測基因型，PCR引物引用文獻中成熟引物，由Invitrogen公司合成。限制性內(nèi)切酶Pvu II從NEBcutter查找并確定。 PCR 體系為 10μl，2×Mix 10μl，Primer F 1μl，Primer R 1μl，DNA 5μl，ddH2O 3μl，退火溫度58℃，PCR產(chǎn)物電泳瓊脂糖凝膠濃度2%，32個循環(huán)后得到長度為254 bp的代表基因型為CC的PCR片段。產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 收集指標(biāo) 外周血白細胞(WBC)、血小板(PLT)、采用XT-2000全自動全血分析儀檢測。尿蛋白、尿WBC采用羅氏Cobas C8000全自動生化分析儀檢測。抗角蛋白抗體(AKA)采用和杰創(chuàng)新診斷試劑公司大鼠食管抗原片間接免疫熒光法檢測患者血清AKA。血清抗CCP抗體檢測采用ELISA法檢測，試劑盒購自德國歐洲診斷試劑公司，操作按照說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計軟件采用SPSS16.0，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()進行統(tǒng)計描述，兩組間比較采用兩組獨立樣本的t檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗；多因素分析采用Logistic回歸分析法；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的MiR-149 rs22928323位點基因多態(tài)性檢測結(jié)果比較 RA組患者的MiR-149 rs22928323位點TC基因型50.00%高于健康組的28.89%(P＜0.05)，RA組的等位基因 T的頻率51.67%顯著的高于健康組的36.67%(P＜0.05)；見表1，圖 1。

表1 兩組患者的MiR-149 rs22928323位點基因多態(tài)性檢測結(jié)果比較[n(%)]

圖1 MiR-149 rs22928323位點的TC、CC、TT三種基因型電泳圖

2.2 兩組患者的一般資料檢測結(jié)果比較 RA組和健康組的年齡、性別、WBC、PLT、尿 WBC比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；RA組的尿蛋白、AKA陽性率、CCP陽性率均顯著的高于健康組(P＜0.05)；見表2。

2.3 多因素分析結(jié)果 Logistic回歸分析顯示：AKA陽性表達、CCP陽性表達、等位基因T的頻率增加是人群RA發(fā)病的獨立危險因素(P＜0.05)；見表3。

3 討論

RA是一種慢性、炎性、系統(tǒng)性的自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜炎，終致關(guān)節(jié)的軟骨、韌帶、肌腱等各種組織以及多臟器損害[5]。RA的發(fā)病機制至今尚未明確，隨著對免疫學(xué)，分子生物學(xué)研究的不斷深入，RA的治療雖取得一定進展，但至今仍處于控制或緩解癥狀階段，至今尚無特效治療。研究認為，遺傳背景、環(huán)境差異、細胞凋亡、病毒感染等因素都與RA的發(fā)病密切相關(guān)[6]。MicroRNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在細胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用[7]。miRNA可以與mRNA結(jié)合來抑制Mrnade轉(zhuǎn)錄，因此對基因表達調(diào)控、細胞周期等生理過程起重要的調(diào)控作用。目前對miRNA的研究較為廣泛,miRNA作為抑癌基因或癌基因與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，低表達的miRNA與細胞分化缺失有關(guān)，在某些腫瘤中 miRNA出現(xiàn)高表達的情況。Chen Y[8]等研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)展譜系及分化程度和 miRNA表達譜一致。miRNA在免疫系統(tǒng)也中發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)[9]，miRNA-520可以使造血干細胞的分化速度明顯加快。

表2 兩組患者的一般資料檢測結(jié)果比較

表3 RA發(fā)病的多因素分析結(jié)果

因此，miRNA被認為是新的疾病標(biāo)記和潛在的疾病治療靶點，研究miRNA的單核苷酸多態(tài)性與疾病的相關(guān)性是很有價值的。目前已有針對RA發(fā)生、發(fā)展中miRNA變化的研究。已有文獻證明某些特定的 miRNA通過對免疫相關(guān)基因的調(diào)節(jié)與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如Zhou[10]等研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-146與RA的發(fā)病密切相關(guān)，可以控制在軟骨和滑膜的炎性反應(yīng)，從而減少骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)感覺過敏。Rodriguez[11]等研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-155可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌來減緩關(guān)節(jié)的損壞。

抗環(huán)瓜氨酸肽(CCP)抗體和抗角蛋白抗體(AKA)是近年來發(fā)現(xiàn)對RA的診斷具有重要價值[12]。兩者聯(lián)合檢測，對于篩查和輔助診斷早期RA有重要價值。PCR—RFLP分析技術(shù)是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的DNA標(biāo)記技術(shù)，原理是檢測DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。應(yīng)用PCR—RFLP，可檢測某一致病基因已知的點突變，進行直接基因診斷。本研究中RA組的AKA陽性率、CCP陽性率均顯著的高于健康組(P＜0.05)；符合文獻報道[13]。 RNA-149 可以負反饋調(diào)節(jié)TLR介導(dǎo)的免疫反應(yīng)過程，RNA-149(MiR-149)rs22928323多態(tài)性位點位于前體，與肺癌、缺血性腦卒中等疾病的發(fā)生相關(guān)。有研究顯示，MiR-149的rs22928323多態(tài)性位點與RA的遺傳易感性相關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示，RA組患者的MiR-149 rs22928323位點TC基因型50.00%高于健康組的28.89%(P＜0.05)。RA組的等位基因T的頻率51.67%顯著的高于健康組的36.67%(P＜0.05)；OR=1.911，表明MiR-149 rs22928323單核苷酸多態(tài)性與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)。與肖茗淵[15]等的研究結(jié)果相一致，即等位基因T為風(fēng)險等位基因。同時Logistic回歸分析顯示：AKA陽性表達、CCP陽性表達、等位基因T的頻率增加是人群RA發(fā)病的獨立危險因素(P＜0.05)。進一步證實了等位基因 T為風(fēng)險等位基因。但具體的調(diào)節(jié)機制尚不明確，目前的分析并沒有發(fā)現(xiàn)三個基因的多態(tài)性與樣本臨床資料的相關(guān)性，因此有待進一步研究。探討miRNA內(nèi)部調(diào)節(jié)機制在疾病發(fā)病中的作用，有助于尋找調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的靶點，以 miRNA為靶點設(shè)計藥物，進行RA靶向治療。

綜上所述，miRNA-149通過對免疫相關(guān)基因的調(diào)節(jié)，其單核苷酸多態(tài)性與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病密切相關(guān)。RNA-149(MiR-149)rs22928323位點等位基因T頻率增加是人群RA發(fā)病的獨立危險因素。隨著研究的不斷深入，以miRNA為靶點設(shè)計藥物，將會為RA的治療帶來新的希望。