魏翔 ，何崇武 ，盛勵 ，張建 ，劉力源 ，謝新華 ，韓佳 ，鄔黎青

(1.南昌大學(xué)第三附屬醫(yī)院病理科,江西 南昌 330006；2.江西省腫瘤醫(yī)院乳腺外科，江西 南昌330006；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院發(fā)熱門診，江西 南昌 330006；4.贛州市人民醫(yī)院病理科，江西 贛州341000

乳腺癌是全球女性最高發(fā)的惡性腫瘤之一，其占到所有女性腫瘤的25%，也是女性腫瘤死亡的主要原因[1]。據(jù)統(tǒng)計在中國僅2015新發(fā)乳腺癌高達(dá)26萬，死亡7萬余例，位居中國女性所有腫瘤發(fā)病率之首,其最主要的死亡原因是腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移[2]。探究腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的機制成為目前研究的熱點問題。腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞自身的能量代謝密切相關(guān)，ATP合酶是線粒體中參與能量代謝的酶，其功能是將ADP和無機磷酸鹽(Pi)合成ATP，以支持細(xì)胞的各種生物學(xué)功能。目前研究表明ATP合酶既在組織器官中參與能量代謝，也參與腫瘤組織的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]。ATP合酶由F0結(jié)構(gòu)域F1結(jié)構(gòu)域兩部分組成，而ATP5B基因編碼F1單位上的β亞基，ATP5B表達(dá)的高低直接影響ATP合酶的功能。目前研究發(fā)現(xiàn)，在不同腫瘤中ATP5B表達(dá)不一，高表達(dá)的有膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[4]、Barrett食管病[5]、卵巢癌[6]等；低表達(dá)的有骨肉瘤。結(jié)直腸癌[8]、膽囊癌[9]等。ATP5B表達(dá)的高低與腫瘤的生物學(xué)行為亦不同，在結(jié)直腸癌及膽囊癌低表達(dá)ATP5B與腫瘤高侵襲性相關(guān)；在卵巢癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中高表達(dá)ATP5B與腫瘤高侵襲性相關(guān)。在乳腺癌中ATP5B蛋白的研究不多，在乳腺癌中ATP5B蛋白表達(dá)的高低及對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響并不明確。本文旨在探究乳腺癌組織中ATP5B蛋白的表達(dá)情況及對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的初步探究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本的收集 經(jīng)患者同意，收集本院乳腺癌組織病理標(biāo)本30例，均為女性患者，每例標(biāo)本均取癌組織及癌旁乳腺組織(距癌組織5cm處的形態(tài)學(xué)正常的乳腺組織)。

1.1.2 實驗細(xì)胞株 實驗所使用的細(xì)胞株均是課題組以前儲備的，五種細(xì)胞株均購自中國科學(xué)院上海分院，其中1株乳腺正常上皮細(xì)胞：HBL-100，4株 乳 腺 癌 細(xì) 胞 ：MCF-7、T-47D、MDA-MB-231、BT-549。所有細(xì)胞株均在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HBL-100、T-47D及 BT-549用 90%1640+10%FBS 培養(yǎng) ，MCF-7、MDA-MB-231 細(xì) 胞 株 用90%DMEN+10%FBS培養(yǎng)。

1.1.3 ATP5B siRNA質(zhì)粒序列檢測 ATP5B單克隆抗體購于Abcam公司，ATP5B siRNA購于銳博生物科技有限公司，ER、PR、HER2、Ki-67 抗體均購自北京中杉金橋。ATP5B siRNA質(zhì)粒序列見表1。

表1 ATP5B siRNA質(zhì)粒序列

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測 ATP5B抗體按1：500稀釋,二抗用通用型鼠/兔二抗-HRP聚合物;ER、PR、HER2及Ki-67抗體均為即用型工作液。按照SP法免疫組化步驟進(jìn)行操作；陰性對照以磷酸鹽緩沖液代替一抗。

1.2.2 免疫組化結(jié)果判讀 ATP5B免疫組化染色定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜。結(jié)果判定采用半定量積分法：(1)按染色強弱計分：深褐色3分，褐色2分，淡褐色1分，無著色0分；(2)根據(jù)陽性腫瘤細(xì)胞百分比計分：陰性0分，＜25%計1分，25%～50% 計2分，51%～75% 計3分，≥75% 計4分。將上述2項得分相乘即為最后評分結(jié)果，0～3分為 (-)，3～5分為(+)，6～8 分為(++)，＞9 分為(+++)。 同時，我們將(++)和(+++)定義為高表達(dá)，(-)和(+)定義為低表達(dá)。每張切片均由兩名高年資的病理醫(yī)師判讀，判讀結(jié)果不一致時討論決定。ER、PR免疫染色定位于細(xì)胞核，采用CPA/ASCO指南的評分標(biāo)準(zhǔn)：免疫組化染色陽性細(xì)胞數(shù)≥1%既判為陽性。Ki-67免疫組化染色定位于細(xì)胞核，按陽性腫瘤細(xì)胞所占百分比判讀。HER2免疫組化染色定位于細(xì)胞膜，其評分標(biāo)準(zhǔn)按2014版乳腺癌HER2檢測指南[10]。

1.2.3 Western Blot檢測 ATP5B蛋白在各乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)，選擇高表達(dá)ATP5B蛋白的細(xì)胞株，ATP5B siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 48h后，Western Blot檢測其沉默效果，選擇沉默效果最佳的質(zhì)粒沉默ATP5B蛋白后，通過細(xì)胞劃痕實驗、Transwell侵移實驗、MTT法分析ATP5B的沉默對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 所得實驗結(jié)果數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計學(xué)分析軟件SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ATP5B蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)高于癌旁乳腺組織 通過觀察鏡下免疫組化染色，我們發(fā)現(xiàn)，ATP5B蛋白在乳腺癌組織及癌旁組織中均有表達(dá)，主要表達(dá)在細(xì)胞漿，見圖1、圖2。將ATP5B蛋白免疫組化評分(-)及(+)定義為低表達(dá)，(++)及(+++)定義為高表達(dá)。將乳腺癌組織和癌旁組織ATP5B蛋白表達(dá)高低情況做統(tǒng)計學(xué)分析，見表2。ATP5B蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常乳腺組織，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 HE(×200)乳腺癌組織及癌旁乳腺組織

圖2 IHC(×200)ATP5B蛋白在乳腺癌組織及癌旁乳腺組織中的表達(dá)

表2 乳腺癌組織和癌旁乳腺組織ATP5B蛋白表達(dá)統(tǒng)計分析

2.2 ATP5B蛋白的表達(dá)與乳腺癌患者的年齡、ER、PR、HER2、Ki-67及淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移情況均無明顯相關(guān)性 收集的30例乳腺癌標(biāo)本均為女性，均為非特殊型浸潤性癌；患者的中位數(shù)年齡為52歲，平均年齡為53.9歲。ATP5B蛋白的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表3，示乳腺癌患者ATP5B蛋白的表達(dá)水平與患者的年齡、ER、PR、HER2、Ki-67 及淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移情況均無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。

表3 乳腺癌患者ATP5B蛋白的表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系

2.3 ATP5B蛋白在T-47D乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)最高通過 Western Blot檢測 HBL-100、MCF-7、T-47D、MDA-MB-231及BT-549細(xì)胞中ATP5B蛋白的表達(dá)情況 以β-actin作為參照蛋白，在5種乳腺細(xì)胞中，均有ATP5B蛋白的表達(dá)，以T-47D乳腺癌細(xì)胞表達(dá)量最高。見圖3。

圖3 Western Blot檢測各細(xì)胞ATP5B的表達(dá)

2.4 si-h-ATP5F1B-002質(zhì)粒沉默T-47D乳腺癌細(xì)胞ATP5B蛋白表達(dá)的效果最佳 在2.3實驗結(jié)果中，以T-47D乳腺癌細(xì)胞ATP5B蛋白表達(dá)量最高，選擇該細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗。根據(jù)ATP5B siRNA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染說明，利用riboFECTTM CP轉(zhuǎn)染試劑，按操作說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48h后提取蛋白，Western Blot檢測各轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組ATP5B蛋白的表達(dá)量，以空白組作為對照，ATP5B蛋白表達(dá)越低，說明質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效力越高。si-h-ATP5F1B-002組ATP5B蛋白表達(dá)最低，其轉(zhuǎn)染效力最高。見圖4。

圖4 Western Blot檢測各質(zhì)粒沉默ATP5B的表達(dá)

2.5 沉默ATP5B可以顯著抑制乳腺癌細(xì)胞T-47D的運動能力 我們選擇ATP5B蛋白表達(dá)量最高的乳腺癌細(xì)胞T-47D，以及轉(zhuǎn)染效力最高的質(zhì)粒sih-ATP5F1B-002進(jìn)行實驗。在24h及48h，質(zhì)粒sih-ATP5F1B-002組細(xì)胞遷移率比對照組和NControl組顯著減小，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，說明沉默ATP5B可以顯著抑制乳腺癌細(xì)胞T-47D的運動能力。見圖5、表4。

圖5 細(xì)胞劃痕實驗分析ATP5B的沉默對癌細(xì)胞運動能力的影響(×100)

表4 細(xì)胞劃痕實驗細(xì)胞移動距離統(tǒng)計分析

2.6 沉默ATP5B可以顯著抑制乳腺癌細(xì)胞T-47D的遷移能力 我們選擇ATP5B蛋白表達(dá)量最高的乳腺癌細(xì)胞T-47D，以及轉(zhuǎn)染效力最高的質(zhì)粒sih-ATP5F1B-002進(jìn)行實驗。質(zhì)粒si-h-ATP5F1B-002組癌細(xì)胞的穿過膜的細(xì)胞數(shù)量顯著比對照組及空載組(NControl)的細(xì)胞數(shù)量少，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而對照組與NControl組穿過膜的細(xì)胞數(shù)量基本一致，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；說明ATP5B的沉默抑制了乳腺癌細(xì)胞T-47D的遷移能力。見圖6、表5。

圖6 Transwell遷移實驗結(jié)果(×200)

表5 Transwell遷移實驗細(xì)胞計數(shù)統(tǒng)計分析

2.7 沉默ATP5B可以顯著抑制乳腺癌細(xì)胞株T-47D的增殖活性 我們選擇ATP5B蛋白表達(dá)量最高的乳腺癌細(xì)胞T-47D，以及轉(zhuǎn)染效力最高的質(zhì)粒si-h-ATP5F1B-002進(jìn)行實驗。質(zhì)粒si-h-ATP5F1B-002組癌細(xì)胞的OD值顯著比對照組及空載組(NControl)的OD值低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；對照組與NControl組癌細(xì)胞的 OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明質(zhì)粒si-h-ATP5F1B-002組癌細(xì)胞的增殖活性比對照組及空載組(NControl)低，ATP5B的沉默抑制了乳腺癌細(xì)胞株T-47D的增殖活性。見表6。

3 討論

ATP5B基因其主要功能是轉(zhuǎn)錄、翻譯成ATP合酶的F1結(jié)構(gòu)域的β亞基，是ATP合酶參與細(xì)胞線粒體能量代謝較為重要的亞基[11]。一直以來，ATP合酶被認(rèn)為只參與細(xì)胞的能量代謝，但近年研究發(fā)現(xiàn)其與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲的許多機制有關(guān)；包括作為內(nèi)皮細(xì)胞表面的血管抑制素受體，參與腫瘤微血管形成的調(diào)控，參與腫瘤細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能。在過去的十年中，ATP合酶已經(jīng)被證明在癌癥中發(fā)揮作用[12-14]。并被認(rèn)為是一種可能的腫瘤非特異性治療靶點，尤其是在細(xì)胞表面表達(dá)時[15-17]。

表6 MTT法分析癌細(xì)胞ATP5B沉默對增殖活性的影響

在眾多研究中均發(fā)現(xiàn)ATP5B蛋白表達(dá)的高低對腫瘤的生物學(xué)影響不同。在大多數(shù)體外腫瘤細(xì)胞株實驗中高ATP5B蛋白的表達(dá)是促進(jìn)腫瘤的增殖及侵襲，例如在前列腺癌細(xì)胞系中。其機制并不明確，目前有學(xué)者提出兩種可能的機制：(1)細(xì)胞表面ATP5B參與產(chǎn)生的ATP產(chǎn)物通過嘌呤受體P2X和嘌呤受體P2Y參與嘌呤能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。ATP合成產(chǎn)物可以刺激嘌呤受體，而嘌呤受體具有多種生物學(xué)功能，包括促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成[18]。ATP合成產(chǎn)物作為小窩內(nèi)的自分泌因子，可刺激嘌呤受體P2Y促進(jìn)細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤生長和血管生成。P2X受體是ATP門控的，Ca2+滲透通道，介導(dǎo)陽離子(Na+，K+和Ca2+)的快速非選擇性通道，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)P2X受體[19]。(2)ATP合酶在內(nèi)皮細(xì)胞表面具有活性，具有轉(zhuǎn)運質(zhì)子和合成ATP的能力，腫瘤細(xì)胞異位或高表達(dá)ATP5B蛋白，增加ATP合酶的活性，可以增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)子的轉(zhuǎn)運，創(chuàng)造腫瘤細(xì)胞內(nèi)生理性的pH環(huán)境和細(xì)胞外的酸性環(huán)境，幫助腫瘤細(xì)胞在高酸性環(huán)境中存活下來；同時細(xì)胞外的酸性微環(huán)境可引起細(xì)胞外基質(zhì)的局部失穩(wěn)，促進(jìn)腫瘤生長和組織侵襲[20]。

亦有研究顯示ATP5B蛋白的低表達(dá)與腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)。研究顯示在膽囊癌中ATP5B蛋白表達(dá)的丟失與腫瘤的大小、高TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，尤其是與較短的生存率有顯著的相關(guān)性[9]。其可能的機制是：(1)Moser等[21-22]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞表面ATP酶是血管抑制素的受體，通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞表面ATP代謝來抑制血管生成。Notari[23]報道，色素上皮衍生因子(Pigment Epithelium Derived Factor,PEDF)作為體內(nèi)血管生成的有效阻滯劑，抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管形成，減少內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外ATP的數(shù)量,并與內(nèi)皮細(xì)胞表面的ATP5B具有較高的親和力，并且還能阻斷ATP5B與血管抑制素的結(jié)合。(2)線粒體除了合成人體所需的ATP以外，它在細(xì)胞死亡的過程中也起著至關(guān)重要的作用,而ATP5B合酶是線粒體在細(xì)胞死亡過程中發(fā)揮作用的關(guān)鍵物質(zhì)。ATP5B合酶通過生成活性氧(ROS)來發(fā)揮作用，而ROS又可以對細(xì)胞及線粒體產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化損害[9]。ATP5B的高表達(dá)已被證實可以在細(xì)胞毒性物質(zhì)的作用下增加細(xì)胞的死亡，而線粒體的失活可以導(dǎo)致ROS信號的減弱及增強對細(xì)胞毒因子的耐受。

在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中ATP5B蛋白的表達(dá)明顯高于癌旁的正常乳腺組織。是否能說明乳腺癌細(xì)胞的能量代謝較正常乳腺細(xì)胞高，其較高的能量代謝是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲的始動因素，還是為適應(yīng)腫瘤細(xì)胞自身的生物學(xué)功能而被動的調(diào)節(jié)呢，這值得我們深入研究。目前在腫瘤中ATP5B蛋白高表達(dá)的機制并不明確，目前對ATP5B蛋白高表達(dá)機制研究較為深入的是在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中。Guiyan Xu等[4]在研究膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)的發(fā)病機理中發(fā)現(xiàn)，利用線粒體和代謝PCR基因陣列對GBM微血管 (從GBM中分離出來的微血管)、正常腦血管和GBM腫瘤細(xì)胞之間的ATP5B mRNA表達(dá)譜進(jìn)行評價，結(jié)果顯示GBM腫瘤細(xì)胞和GBM微血管中ATP5B的mRNA水平顯著高于正常腦血管。且組織微陣列免疫組化染色，也顯示ATP5B在GBM腫瘤細(xì)胞和GBM微血管中強烈陽性，而在正常血管中為陰性。通過分析281個GBM病例和其他癌癥的癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)，只有很少比例的GBM病例有ATP5B的突變或擴增，沒有病例出現(xiàn)ATP5B基因被刪除。并且ATP5B基因擴增的GBM病例ATP5B信使RNA表達(dá)增加并不顯著?？梢奊BM基因組ATP5B DNA的改變并不是GBM高表達(dá)ATP5B的主要原因，由此推測在GBM發(fā)病機制中存在對ATP5B基因組轉(zhuǎn)錄的調(diào)控機制。在乳腺癌中是否存在類似的機制，亦需進(jìn)一步的深入研究。

腫瘤對機體最大的損害是在人體內(nèi)的侵襲和轉(zhuǎn)移，在乳腺癌中HER2的高表達(dá)或擴增及高的Ki-67增殖指數(shù)預(yù)示著乳腺癌患者較差的預(yù)后。那么乳腺癌ATP5B蛋白的高表達(dá)與乳腺癌的預(yù)后是否具有相關(guān)性，通過統(tǒng)計學(xué)分析ATP5B蛋白的表達(dá)與乳腺癌預(yù)后差的指標(biāo)HER2及Ki-67的相關(guān)性，以及直接統(tǒng)計ATP5B蛋白的表達(dá)與患者預(yù)后差的指標(biāo)淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)ATP5B蛋白的表達(dá)與乳腺癌HER2及Ki-67并無明顯相關(guān)性，且與另一個反映預(yù)后的指標(biāo)淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移也無明顯相關(guān)性。不排除我們研究的標(biāo)本量太小，存在統(tǒng)計學(xué)上的誤差的可能。

在進(jìn)一步實驗中，我們運用了RNA干擾技術(shù)，這是一種在基因轉(zhuǎn)錄后沉默其目標(biāo)mRNA的技術(shù)。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染導(dǎo)入大量siRNA可以在短時間內(nèi)對特定基因進(jìn)行沉默，從而進(jìn)行基因功能的研究[24]。在我們的研究中，發(fā)現(xiàn)沉默ATP5B蛋白的表達(dá)可以顯著抑制乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲性。實驗結(jié)果進(jìn)一步驗證了在乳腺癌細(xì)胞中ATP5B蛋白的高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力，而抑制ATP5B蛋白的表達(dá)可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力。這為ATP5B抑制劑的研發(fā)提供了契機，也為乳腺癌的非特異性的靶向治療提供了可能。

盡管ATP5B抑制劑具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲的功能，但目前為止并沒有很特異的ATP5B抑制劑應(yīng)用于腫瘤的靶向治療。其原因是ATP合酶在人體許多細(xì)胞膜表面都表達(dá)，雖然在ATP5B在腫瘤中和正常組織的表達(dá)量不是一樣，但一樣會引起人體的不良反應(yīng)，尤其是包括心臟在內(nèi)的人體重要器官的損害。所以在使用ATP5B抑制劑時，必須要對人體器官功能進(jìn)行監(jiān)測。但是，如果這些抑制劑可以對腫瘤只起局部作用，比如腫瘤內(nèi)給藥或灌注，對其他器官的副作用可能是最小的，亦有希望應(yīng)用于臨床腫瘤患者的治療。

(收稿日期2018-07-16，修回日期2018-11-03)