王明剛 陳 乞 高 翔 葉之華 肖明中 李瀚旻,△

1.湖北中醫(yī)藥大學中醫(yī)臨床學院 (湖北 武漢, 430065) 2.湖北省中醫(yī)院 3.湖北省中醫(yī)藥研究院

原發(fā)性肝癌(PLC)是我國常見惡性腫瘤，肝細胞癌(HCC)是其主要類別，在全部惡性腫瘤中順位死亡率中已上升至第2位，占全球PLC死亡率的51%左右[1, 2]。在我國HBV感染相關(guān)HCC占絕大部分?？紤]到龐大的HBsAg陽性感染率，肝癌人口標化率(中標率)呈逐步上升趨勢[3]?？傮w上看HCC具備發(fā)病隱匿、高發(fā)病率、高死亡率、高年增率的特性，是學術(shù)界公認的重大疑難疾病[4]。

如何切實有效地提高肝癌臨床治療效果是學術(shù)界面臨的巨大挑戰(zhàn)，中醫(yī)肝病專家李瀚旻教授提出 “髓失生肝”的肝癌病理機制，形成“補腎生髓成肝”防治肝癌的治療法則[5]。凝練為地五養(yǎng)肝膠囊(由熟地、五味子、姜黃、茵陳、甘草等組成)這一經(jīng)典方藥，臨床研究證實地五養(yǎng)肝膠囊能顯著降低肝硬化發(fā)生率，改善肝再生微環(huán)境，降低肝癌發(fā)生率和肝癌發(fā)生風險[6]。機制研究發(fā)現(xiàn)該方能影響JAK/STAT、Ras/Raf/Mek/Erk信號通路相關(guān)蛋白表達，抑制骨髓干細胞轉(zhuǎn)化肝癌干細胞，促進肝細胞再生修復，改善肝再生微環(huán)境而抑制肝癌發(fā)生發(fā)展[5]。為深入探索地五養(yǎng)肝膠囊防治肝癌的分子機制，構(gòu)建地五養(yǎng)肝膠囊防治肝癌的生物信息網(wǎng)絡(luò)，本研究將采用Solt-Farber二步法構(gòu)建肝癌大鼠模型，地五養(yǎng)肝膠囊干預治療，收集肝癌組織，采用表達譜芯片檢測，提取mRNA差異表達信息進行生物信息學綜合分析，為深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 4～5周齡SD雄性大鼠，SPF級，體重(150±50)g，由湖北省疾病預防控制中心提供；二乙基亞硝胺(DEN)及二乙酰氨基芴(2-AAF) 購于sigma公司，地五養(yǎng)肝膠囊(批號：鄂藥制藥字Z20113160)由湖北省中醫(yī)院肝病研究所提供。

1.2 造模方法 雄性SPF級SD大鼠，48只，4-5周齡，體重(150±50)g。大鼠按隨機數(shù)字法分為空白對照組(Normal)、模型組(Model)、地五養(yǎng)肝治療組(DWYG)每組16只。造模第1天，模型組與地五養(yǎng)肝治療組按50mg/kg的劑量一次性腹腔注射二乙基亞硝胺(DEN)作為啟動劑，2周后均按15mg/kg/d劑量予以二乙酰氨基芴(2-AAF)灌胃7天，第3周末行2/3肝部分切除術(shù)(PHx)，切除肝左葉和中葉。地五養(yǎng)肝治療組于造模期間按750mg/kg/d劑量給予地五養(yǎng)肝膠囊水溶液灌胃、空白對照組則給予等量生理鹽水灌胃對照。

1.3 標本收集與芯片檢測 成模后地五養(yǎng)肝膠囊中藥干預16周，16周后即時處死各組大鼠，取腫瘤組織，Trizol法提取總RNA，測定RNA濃度，全部芯片檢測樣本均質(zhì)量控制合格，使用Arraystar RNA Flash Labeling Kit對樣本進行標記，使用Agilent SureHyb進行雜交實驗。使用Agilent GeneSpring GX v12.1進行芯片標準化操作，挑選差異表達的mRNAs。topGO軟件對差異mRNAs進行GO分析與PATHWAY分析。

2 結(jié)果

2.1 地五養(yǎng)肝膠囊可影響大鼠肝癌組織多個mRNA表達 以Fold Change>2，P<0.05為條件進行差異mRNA篩選，與模型組比較地五養(yǎng)肝膠囊下調(diào)481個大鼠mRNA表達，上調(diào)236個mRNA表達，差異表達聚類熱圖如下。

2.2 地五養(yǎng)肝膠囊調(diào)控的差異mRNA GO分析

2.2.1 地五養(yǎng)肝膠囊下調(diào)的mRNA GO分析 對地五養(yǎng)肝膠囊下調(diào)的481個mRNA進行GO分析，在生物學過程中可影響細胞損傷反應(yīng)(化學應(yīng)激)、細胞組織發(fā)育過程，循環(huán)系統(tǒng)(微血管育)發(fā)育等過程；在細胞組份中可影響細胞外基質(zhì)、細胞外囊泡、細胞外膜結(jié)合、膜結(jié)合囊泡；生物學功能可影響蛋白質(zhì)結(jié)合、鈣離子結(jié)合、細胞粘附分子結(jié)合、生長因子結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚體活性等功能。見表1。

2.2.2 地五養(yǎng)肝膠囊上調(diào)的mRNA GO分析 對地五養(yǎng)肝膠囊上調(diào)的236個mRNA表達進行GO分析，在生物學過程中可影響細胞間粘附、細胞內(nèi)受體信號通路、類固醇激素反應(yīng)、有機環(huán)狀化合物反應(yīng)等過程，在細胞組份中可影響離子通道復合體、跨膜轉(zhuǎn)運復合體、突觸膜、質(zhì)膜區(qū)等細胞組份。在分子功能中可影響金屬離子結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性，配體激活序列特異性DNA結(jié)合、類固醇激素受體等分子生物功能。見表2。

2.3 地五養(yǎng)肝膠囊調(diào)控的差異mRNA PATHWAY分析

2.3.1 地五養(yǎng)肝膠囊下調(diào)的mRNA PATHWAY分析 地五養(yǎng)肝膠囊下調(diào)的481個mRNA進行PATHWAY分析，發(fā)現(xiàn)其可影響緊密連接信號途徑、造血細胞功能途徑、膽汁分泌信號通路、肌動蛋骨架調(diào)節(jié)通路、ECM受體相互作用通路、細胞因子-受體相互作用通路等。見圖1。

圖1 地五養(yǎng)肝膠囊下調(diào)的mRNA PATHWAY分析

2.3.2 地五養(yǎng)肝膠囊上調(diào)的mRNA PATHWAY分析 地五養(yǎng)肝膠囊下調(diào)的236個mRNA進行PATHWAY分析，發(fā)現(xiàn)其可影響癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)信號通路、GnRH信號通路、糖酵解/糖異生信號通路、PPAR信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路、TRP通道炎癥介質(zhì)調(diào)控信號通路等。見圖2。

圖1 地五養(yǎng)肝膠囊上調(diào)的mRNA PATHWAY分析

3 討論

長期以來，肝癌的防治策略多集中在腫瘤細胞本身，外科手術(shù)切除、放療、化療均以有效清除或殺死腫瘤細胞為目標，隨著對肝癌防治水平未見實質(zhì)性提高的反思及對發(fā)病機制復雜性的深入認識，近年來在對肝癌發(fā)病機制及防治策略上逐步由著眼肝癌細胞本身向肝癌微環(huán)境方向轉(zhuǎn)變，已形成新的肝癌防治策略[7]。肝癌微環(huán)境指非肝癌細胞和細胞外基質(zhì)所共同構(gòu)成的復雜混合物，從類別上區(qū)分，HCC微環(huán)境主要包括了纖維化微環(huán)境、血管微環(huán)境、免疫微環(huán)境、氧化微環(huán)境和干細胞微環(huán)境等。 這些微環(huán)境之間存在相互關(guān)聯(lián)、相互影響的復雜關(guān)系[8]，但難以形成關(guān)鍵概念來統(tǒng)籌這些微環(huán)境的根本落腳點。肝病專家李翰旻教授提出肝癌異常肝再生微環(huán)境的基本概念[7,9]，認為HCC的發(fā)生與發(fā)展其本質(zhì)是異常肝再生微環(huán)境的形成與維持過程，各種肝癌微環(huán)境可與肝再生異常微環(huán)境產(chǎn)生直接或間接的復雜影響關(guān)系，并提出基于“補腎生髓成肝”的中醫(yī)藥改善肝再生微環(huán)境防治HCC的治療新策略，充分發(fā)揮中醫(yī)藥防治肝癌的多次層、多時限、整體、動態(tài)調(diào)控的療效優(yōu)勢[10]。

表1 地五養(yǎng)肝膠囊下調(diào)的mRNA GO分析

地五養(yǎng)肝膠囊正是在“補腎生髓成肝”防治肝癌理論指導下形成的有效中藥制劑，方中熟地滋陰補腎，五味子柔肝補腎，兩藥相合增強補腎之功；茵陳清熱利濕而退黃，姜黃活血化瘀而通絡(luò)，生甘草清熱解毒。甘草與五味子清熱養(yǎng)陰、酸甘化陰，全方共奏補腎養(yǎng)肝、利濕退黃、活血通絡(luò)之效。前期研究已經(jīng)證實該方具有防治肝癌發(fā)生與發(fā)展的臨床治療效果，本研究構(gòu)建了大鼠肝癌模型，地五養(yǎng)肝膠囊進行干預處理，發(fā)現(xiàn)該方可上調(diào)肝癌組織236個mRNA表達，下調(diào)481個mRNA表達，體現(xiàn)出該方存在的多層次、多靶點、多途徑發(fā)揮療效機制的可能。在對地五養(yǎng)肝膠囊下調(diào)的481個mRNA進行GO分析中發(fā)現(xiàn)，該方可影響細胞損傷反應(yīng)(化學應(yīng)激)、循環(huán)系統(tǒng)(微血管)發(fā)育過程；影響細胞外基質(zhì)、細胞外囊泡、細胞外膜結(jié)合等細胞組份；影響蛋白質(zhì)結(jié)合、鈣離子結(jié)合、細胞粘附分子結(jié)合、生長因子結(jié)合等功能。在對地五養(yǎng)肝膠囊上調(diào)的236個mRNA表達進行GO分析，在生物學過程中可影響細胞間粘附、細胞內(nèi)受體信號通路、類固醇激素反應(yīng)、有機環(huán)狀化合物反應(yīng)等過程，在細胞組份中可影響離子通道復合體、跨膜轉(zhuǎn)運復合體、突觸膜、質(zhì)膜區(qū)等細胞組份。在分子功能中可影響金屬離子結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性，配體激活序列特異性DNA結(jié)合、類固醇激素受體等分子生物功能。綜合分析，地五養(yǎng)肝膠囊可調(diào)控細胞損傷反應(yīng)、循環(huán)系統(tǒng)(微血管)發(fā)育過程這可能與阻斷肝臟腫瘤惡性增生及微血管新生存在關(guān)聯(lián)，并且可影響腫瘤組織細胞外基質(zhì)和細胞外囊泡傳遞等細胞組份及細胞間交流方式。

地五養(yǎng)肝膠囊下調(diào)的481個mRNA進行PATHWAY分析，發(fā)現(xiàn)其可影響緊密連接信號途徑、造血細胞功能途徑、膽汁分泌信號通路、肌動蛋白骨架調(diào)節(jié)通路、ECM受體相互作用通路、細胞因子-受體相互作用通路等相關(guān)。地五養(yǎng)肝膠囊下調(diào)的236個mRNA進行PATHWAY分析，發(fā)現(xiàn)其可影響癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)信號通路、GnRH信號通路、糖酵解/糖異生信號通路、PPAR信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路、TRP通道炎癥介質(zhì)調(diào)控信號通路等。這些信號通路均與肝癌的發(fā)生與發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，深入探索地五養(yǎng)肝膠囊通過影響以上信號途徑發(fā)揮的療效機制有重要現(xiàn)實意義。