彭孟云，陳然，朱曉寧，汪靜*

(1. 西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院肝膽病科，四川 瀘州 646000； 2. 西南醫(yī)科大學，四川 瀘州 646000)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是指各種致病因子長期反復刺激肝，導致細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積于肝的一種慢性肝損傷的修復反應，是導致肝硬化、肝癌等終末期肝病的主要原因[1]。轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β1被認為是HSCs激活過程中最重要的因子，在肝纖維化形成中發(fā)揮重要作用，Smad 蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein)是TGF-β1 信號傳至核內(nèi)關(guān)鍵的下游信號分子， TGF-β1通過激活下游介質(zhì)Smad2和Smad3發(fā)揮其促肝纖維化的作用，研究表明四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)誘導的肝纖維化小鼠中Smad2/3表達明顯升高[2]。而Smad7作為TGF-β1/Smad信號通路的負調(diào)控因子，主要通過與Smad3競爭性抑制中斷TGF-β1信號轉(zhuǎn)導以抑制肝纖維化進展，敲除Smad7基因可促進小鼠肝纖維化的發(fā)生[3]，表明TGF-β1/Smad 信號通路及相關(guān)的細胞因子在肝纖維化中發(fā)揮重要作用。

中醫(yī)并無“肝纖維化”這一病名，常將其隸屬“積聚”范疇。全國名中醫(yī)孫同郊教授根據(jù)數(shù)十年治療肝纖維化的臨床經(jīng)驗，認為氣虛血瘀是本病的基本病機，以補氣扶正、活血化瘀為基本治療，在此基礎上自擬了具有益氣活血化瘀功效的的參仁活血顆粒用于治療肝纖維化，臨床療效顯著。本研究采用參仁活血顆粒治療肝纖維化大鼠，觀察參仁活血顆粒對肝纖維化大鼠TGF-β1/Smad信號通路的調(diào)節(jié)作用，探討參仁活血顆粒治療肝纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

6周齡清潔級雄性SD大鼠50只，體重(200 ± 20) g，購自西南醫(yī)科大學實驗動物中心【SCXK(川) 2018-065】，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學動物實驗中心【SYXK(川) 2018-065】，標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水。大鼠均分籠飼養(yǎng)，每籠5只，光照與黑暗各12 h交替處理，濕度為50% ～ 60%，溫度為20 ～ 22°C，適應性喂養(yǎng)1周。

1.1.2 實驗藥物和試劑

參仁活血顆粒由西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室制備(規(guī)格：10 g/袋，批號：20150814)；四氯化碳(批號:2016062301)購自成都市科龍化工試劑廠；TGF-β1抗體、Smad3抗體、Smad7抗體、CollagenⅠ抗體及Collagen Ⅲ抗體均購自美國Abcam公司；總RNA提取試劑盒(離心柱型)購自北京天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；SYBR Green Real-time PCR Master Mix購自日本Toyobo公司；RIPA裂解液(強)及PMSF購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.1.3 主要設備與儀器

超低溫冰箱(美國Thermo公司)；正置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；高速低溫離心機(美國Sigma公司)；實時熒光定量 PCR儀(德國Eppendorf公司)；PCR擴增儀、全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、凝膠掃描成像系統(tǒng)及熒光化學發(fā)光圖像分析儀均來自美國Bio-Bod公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、造模及給藥

50只雄性SD大鼠隨機分為參仁活血顆粒低劑量組、參仁活血顆粒中劑量組、參仁活血顆粒高劑量組、正常組及模型組，每組10只，均予以標準飼料喂養(yǎng)，均正常自由活動和飲用自來水。正常組腹腔注射生理鹽水1 mL/kg，2次/周，共8周；模型對照組及中藥各組均給予40%四氯化碳0.2 mL/100 g，腹腔注射，2次/周，共8周。于第4周開始分別給予參仁活血顆粒低[每日1.575 g/(kg·bw)]、中[每日3.15 g/(kg·bw)]、高 [每日6.3 g/(kg·bw)) 劑量灌胃，于第8周犧牲。

1.2.2 肝病理學與免疫組化觀察

取新鮮肝固定脫水包埋后切片，HE染色及Masson染色觀察大鼠肝纖維化程度。免疫組化檢測大鼠肝TGF-β1、collagenⅠ、collagen Ⅲ的表達。

1.2.3 Real-time PCR檢測大鼠肝TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA的表達

引物由上海生工生物公司合成，TGF-β1(120 bp)上游5’ATTCCTGGCGTTACCTTGG3’，下游5’AGCCCTGTATTCCGTCTC CT3’；Smad3(110 bp)上游5’GAGACATTCCACGCTTCACA3’，下游5’GCTGCATTCCGGTTAACATT3’；Smad7(128 bp)上游5’GTGGC ATACTGGGAGGAGAA3’，下游5’TTGTTGTCCGAATTGAGCTG3’； β-actin(150 bp)上游5’CCCATCTATGAGGGTTACGC3’，下游5’TTT AATGTCACGCACGATTTC3’。提取肝組織RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按SYBR Green Real-time PCR Master Mix試劑盒進行Real-time PCR，反應條件：95℃ 15 s(變性)、55℃ 10 s(退火)、72℃ 20 s(延伸)，循環(huán)40次，目的基因的表達量使用2-△△ct法計算。

1.2.4 Western blot檢測大鼠肝TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白的表達

100 mg的肝組織加入900 μL配置好的RIPA 裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，蛋白熱變性后經(jīng)SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h, TBST搖洗膜，加入稀釋好的一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜，稀釋好的二抗常溫孵育1 h，TBST洗膜，于PVDF膜正面加適量HRP substrate顯影液，在BioRad GelDocXR儀器上進行信號檢測，利用Gel-Pro Analyzer 軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 HE染色及Masson染色觀察大鼠肝病理改變

正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、完整，肝細胞排列整齊，未見細胞壞死。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)嚴重破壞，肝細胞排列錯亂，存在不同程度的小葉內(nèi)壞死、碎屑樣壞死及橋接壞死，大量膠原沉積，假小葉形成。參仁活血顆粒低、中劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)分別呈中-重度、輕-中度破壞，肝細胞排列不整齊，存在不同程度的炎性細胞浸潤及細胞壞死，纖維結(jié)締組織增生，其中低劑量組膠原較多沉積，中劑量組膠原沉積較前減少。而高劑量組可見部分接近正常的肝小葉結(jié)構(gòu)，少量纖維結(jié)締組織增生，纖維化程度較模型組明顯改善。(圖1、圖2)。

2.2 各組大鼠肝TGF-β1、collagenⅠ、collagen Ⅲ的表達

正常組大鼠肝TGF-β1、collagenⅠ、collagen Ⅲ無陽性表達意義，模型組大鼠肝collagenⅠ、collagen Ⅲ及TGF-β1較正常組顯著表達，而參仁活血顆粒各劑量TGF-β1、collagenⅠ、collagen Ⅲ表達均較模型組降低，且表達程度與劑量呈負相關(guān)，以參仁活血顆粒高劑量組療效最顯著(圖3、圖4、圖5)。

注：A 正常組；B 模型組；C 中藥低劑量組；D 中藥中劑量組；E 中藥高劑量組。(下圖同)圖1 各組大鼠肝HE染色Note. A. Control group. B. Model group. C. Low-dose SRHX group. D. Middle-dose SRHX group. E. High-dose SRHX group.(The same in the following figures)Figure 1 Pathological changes in liver tissues of the rats in each group(HE staining)

圖2 各組大鼠肝Masson染色Figure 2 Liver fibrosis in the rats of different groups(Masson staining)

圖3 各組大鼠肝collagenⅠ的表達Figure 3 Expression of collagenⅠin liver tissues of the rats in each group

圖4 各組大鼠肝collagenⅢ的表達Figure 4 Expression of collagen Ⅲ in liver tissues of the rats in each group

圖5 各組大鼠肝TGF-β1的表達Figure 5 Expression of TGF-β1 in liver tissues of the rats in each group

2.3 各組大鼠肝TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA表達

與正常組比較，模型組大鼠肝組織TGF-β1、Smad3 mRNA的表達明顯升高而Smad7 mRNA的表達明顯降低(P< 0.05)；參仁活血顆粒各劑量組TGF-β1、Smad3 mRNA的表達較模型組均不同程度降低，以高劑量組效果最佳(P< 0.05)。而參仁活血顆粒各劑量組Smad7 mRNA的表達較模型組明顯升高，呈現(xiàn)出與劑量成正相關(guān)的上調(diào)趨勢，以高劑量組表達升高最為顯著(P< 0.05)。(見圖6)

注：與正常組比較,ΔP< 0.05。與模型組比較，*P< 0.05。處理間比較，°P> 0.05。處理間比較，■P< 0.05。(下圖同)圖6 各組大鼠肝TGF-β1、Smad 3、Smad 7 mRNA表達水平Note. Compared with the normal group, ΔP< 0.05. Compared with the model group, *P< 0.05. Compared between treatments, °P> 0.05. Compared between treatments, ■P< 0.05.(The same in the following figure)Figure 6 Expression of TGF-β1, Smad 3 and Smad 7 mRNA in liver tissues of the rats in each group

2.4 各組大鼠肝TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白的表達

與正常組相比，模型組大鼠肝組織中TGF-β1 蛋白的表達明顯增加(P< 0.05)，與模型組相比，參仁活血顆粒各劑量組大鼠肝組織中TGF-β1蛋白的表達減少(P< 0.05)，但參仁活血顆粒高、中、低劑量組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。與正常組相比，模型組大鼠肝組織中Smad3 蛋白的表達明顯升高而Smad7 蛋白的表達顯著下降(P< 0.05)；參仁活血顆粒各劑量組大鼠肝組織中Smad3 蛋白的表達較模型組降低而Smad7 蛋白的表達較模型組明顯升高，以參仁活血顆粒高劑量組療效最佳(P< 0.05)。(見圖7)

圖7 各組大鼠肝TGF-β1、Smad 3、Smad 7蛋白表達Figure 7 Expression of TGF-β1, Smad 3 and Smad 7 proteins in liver tissues of the rats

3 討論

肝纖維化是肝對各種慢性損傷如肝炎、自身免疫反應、過敏反應、代謝綜合征和炎癥等的修復反應，以富含I型膠原的ECM在肝內(nèi)大量合成并沉積為其主要特征，而ECM主要來源于肝星狀細胞的激活[4-5]。在各種肝損傷致病因素或血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、TGF-β、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)和白介素1(interleukin，IL-1)等炎癥細胞因子的刺激下，HSCs激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6-7]，導致大量collagen I、collagen III和纖維連接蛋白、透明質(zhì)酸等ECM成分的產(chǎn)生，最終導致肝纖維化，其中collagen I的沉積量與肝纖維化的嚴重程度呈正相關(guān)。本研究采用CCl4成功構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，模型組大鼠存在大量膠原沉積，纖維間隔增多增寬，假小葉形成，collagen I及collagen III蛋白表達明顯升高，而經(jīng)參仁活血顆粒治療后，肝膠原沉積減少，肝炎癥及纖維化程度明顯降低，collagen I、collagen III蛋白的表達較模型組明顯降低，以高劑量組療效最佳，表明參仁活血顆粒具有治療大鼠肝纖維化的作用。

TGF-β1是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的致肝纖維化的細胞因子[8]，正常情況下肝TGF-β1 的表達極少，而肝損傷時其表達明顯增加。Smad作為TGF-β1信號傳遞的關(guān)鍵下游蛋白，將細胞外信號傳至核內(nèi)，調(diào)節(jié)核內(nèi)靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮TGF-β1的生物效應[9]。TGF-β1先后與TβR II、TβR I結(jié)合，激活TβR II磷酸化激酶，TβR I隨之磷酸化活化，活化的TβRⅠ催化其下游信號分子Smad2/3蛋白磷酸化，活化的Smad2/3 蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，與Smad 4結(jié)合形成異源寡聚物轉(zhuǎn)運至細胞核內(nèi)，增加金屬蛋白酶組織抑制劑 (tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP)及膠原纖維等的表達，從而激活HSCs[10]；Smad7對TGF-β1信號轉(zhuǎn)導起負調(diào)控作用，通過同Smad2/3與Smad4競爭性的結(jié)合TβR I從而有效阻斷TGF-β1信號轉(zhuǎn)導發(fā)揮抗纖維化的作用。經(jīng)BMP-7 轉(zhuǎn)染日本血吸蟲誘導的肝纖維化小鼠模型中，α-SMA、TGF-β1、Smad2、及Smad3的表達均降低，而Smad7的表達明顯升高[11]。Smad3基因敲除小鼠肝纖維化相關(guān)因子、膠原蛋白表達明顯下降，Smad7表達則呈增長趨勢[12]。Smad7基因敲除大鼠的HSCs數(shù)目增多，ECM大量沉積，而Smad7蛋白表達增加可以抑制HSC增殖及Ⅰ型膠原的產(chǎn)生，抑制肝纖維化的進展[3,13-14]。因此，TGF-β1/Smad信號通路在大鼠肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，抑制該信號通路及相關(guān)細胞因子的表達可能成為治療肝纖維化的關(guān)鍵點。

中醫(yī)藥在防治肝纖維化的發(fā)生發(fā)展方面取得了一些重要進展。Yang等[15]采用復方鱉甲軟肝片治療CCl4誘導的肝纖維化大鼠，結(jié)果顯示該藥物能有效抑制TGF-β/Smad信號通路的激活，從而達到治療肝纖維化的目的。Li等[16]研究發(fā)現(xiàn)由冬蟲夏草菌絲體多糖(CS-PS)，絞股藍總皂苷和苦杏仁苷組成CGA中藥配方能顯著改善DMN誘導的大鼠肝纖維化，其作用機制可能與CGA中藥配方能顯著降低DMN誘導的纖維化肝組織中α-SMA、TGF-β1、TβRI、p-TβRI、p-TβRII、p-Smad2和p-Smad3蛋白質(zhì)表達水平相關(guān)。Wang等[17]發(fā)現(xiàn)扶正化瘀方能顯著降低MCD構(gòu)建的脂肪性肝炎纖維化小鼠TGF-β1，Smad3和Smad4的表達，并進一步上調(diào)Smad7的表達，其機制可能與扶正化瘀方抑制TGF-β1/Smad通路中涉及的細胞因子的表達從而中斷肝纖維發(fā)生中的正反饋環(huán)相關(guān)。本次實驗結(jié)果顯示，參仁活血顆粒能顯著降低肝纖維大鼠肝TGF-β1及Smad3的表達，上調(diào)Smad7的表達，說明TGF-β1/Smad信號通路是參仁活血顆粒治療肝纖維的作用機制之一。進一步分析研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)參仁活血顆粒中、高劑量組之間TGF-β1、Smad7 mRNA的表達差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)，而兩組之間Smad7蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。這可能是由于DNA中遺傳信息的表達必須經(jīng)過中介產(chǎn)物，即轉(zhuǎn)移到mRNA上，才被用于指導蛋白質(zhì)的生物合成，而mRNA將遺傳信息轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中，需經(jīng)形成起始物、活化氨基酸、合成肽鏈的起始部分、肽鏈的延伸和終止、蛋白質(zhì)的加工多個步驟最終才能完成蛋白質(zhì)的合成，若此過程中任一條件受干擾均可影響蛋白的合成，導致蛋白合成受阻所致。通過本次研究，可得出結(jié)論：參仁活血顆粒具有顯著的抗肝纖維化的療效，其機制可能與參仁活血顆粒抑制TGF-β1、Smad3的表達，上調(diào)Smad7的表達，抑制TGF-β1/Smad信號通路激活，減少HSCs的生成，從而減少collagenⅠ及collagen Ⅲ等細胞外基質(zhì)的合成相關(guān)。