黃忠強(qiáng)，劉書(shū)華，關(guān)雅倫，李韻峰，李雪嬌，黃韌，張鈺，李舸

(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣州 510663)

在以實(shí)驗(yàn)猴開(kāi)展的研究中，通過(guò)對(duì)動(dòng)物的行為進(jìn)行評(píng)估對(duì)于正確理解疾病的機(jī)制并準(zhǔn)確評(píng)價(jià)新療法的有效性和安全性至關(guān)重要?？茖W(xué)家們?cè)谏砘虿±項(xiàng)l件下，利用實(shí)驗(yàn)猴的行為特征與腦區(qū)功能變化的相關(guān)性，通過(guò)評(píng)價(jià)動(dòng)物行為進(jìn)而反映病生理過(guò)程中大腦功能的改變。哺乳動(dòng)物大腦單側(cè)感知和運(yùn)動(dòng)功能的缺陷與對(duì)側(cè)相關(guān)腦區(qū)的損傷程度密切相關(guān)[1]，對(duì)于實(shí)驗(yàn)猴，考慮到動(dòng)物福利和個(gè)體差異等因素，通常構(gòu)建單側(cè)腦損傷模型，并通過(guò)行為學(xué)評(píng)價(jià)對(duì)比研究腦健側(cè)和損傷側(cè)功能差異。本研究利用山和谷階梯任務(wù)實(shí)驗(yàn)裝置，分別對(duì)實(shí)驗(yàn)猴左右手抓取功能進(jìn)行測(cè)試，評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)猴單側(cè)大腦損傷對(duì)單側(cè)感知空間和運(yùn)動(dòng)功能缺陷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)7 ～ 9歲雄性食蟹猴8只，分別購(gòu)自廣東春盛生物科技發(fā)展有限公司【SCXK(粵)2014-0027】和從化市華珍動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)【SCXK(粵)2015-0028】。食蟹猴飼養(yǎng)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所普通級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室【SYXK(粵)2016-0122】，環(huán)境為12/12 h晝夜周期，濕度40%～70%，溫度(21±2)℃，每天飼喂2次，其中1次飼喂水果。本研究所涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所(AAALAC認(rèn)證機(jī)構(gòu))動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)IACUC2018014)，并符合中華人民共和國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l理》。

1.1.2 儀器

實(shí)驗(yàn)猴單側(cè)腦損傷行為評(píng)價(jià)所使用山和谷階梯任務(wù)試驗(yàn)裝置由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)[2]。山階梯裝置由猴籠、山階梯和人員觀察擋板組成(圖1)。猴籠正面樹(shù)脂玻璃面板的左右兩側(cè)各開(kāi)一個(gè)僅允許動(dòng)物單側(cè)上肢通過(guò)的狹窄通道，在樹(shù)脂玻璃面板外放置兩個(gè)分別從左右兩側(cè)向面板中央位置逐漸上升的階梯，兩個(gè)階梯最底層臺(tái)階與樹(shù)脂面板上的狹窄通道齊平，最高層在面板中央?yún)R合，階梯共5層，并由一塊樹(shù)脂玻璃將兩個(gè)階梯完全隔開(kāi)，實(shí)驗(yàn)時(shí)，猴僅能通過(guò)右手伸到右側(cè)或左手伸到左側(cè)的階梯獲取食物獎(jiǎng)勵(lì)。

谷階梯裝置由猴籠、谷階梯裝置和人員觀察擋板組成(圖2)。猴籠正面樹(shù)脂玻璃面板的中央開(kāi)一個(gè)僅允許動(dòng)物單側(cè)上肢通過(guò)的狹窄通道，在樹(shù)脂玻璃面板外分別放置兩個(gè)由面板中央位置向兩側(cè)逐漸上升的階梯，兩個(gè)階梯最底層臺(tái)階在樹(shù)脂面板中央?yún)R合并與面板上的狹窄通道齊平，階梯共5層，實(shí)驗(yàn)時(shí)，動(dòng)物僅能通過(guò)右手伸到左側(cè)或左手伸到右側(cè)階梯獲取食物獎(jiǎng)勵(lì)。

圖1 山階梯任務(wù)試驗(yàn)裝置Figure 1 Testing apparatus for hill staircase tasks

圖2 谷階梯任務(wù)試驗(yàn)裝置Figure 2 Testing apparatus for valley staircase tasks

1.2 方法

1.2.1 食蟹猴單側(cè)腦損傷模型制備

四足機(jī)器人(quadruped robot，QR)屬于足式機(jī)器人，相對(duì)于履帶式和輪式機(jī)器人，具有機(jī)動(dòng)性好、環(huán)境破壞程度小、主動(dòng)隔振等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景良好。該型機(jī)器人涉及力學(xué)、機(jī)械學(xué)、生物學(xué)、計(jì)算機(jī)、人工智能等多學(xué)科，相關(guān)技術(shù)一直是國(guó)內(nèi)外機(jī)器人領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。以美國(guó)卡耐基梅隆大學(xué)的波士頓動(dòng)力實(shí)驗(yàn)室為代表，2005年發(fā)布了Big Dog大狗機(jī)器人，又先后推出了如Alpha Dog、Little Dog、Cheetah等產(chǎn)品，引起行業(yè)內(nèi)的廣泛關(guān)注。

(1)單側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈注射MPTP誘導(dǎo)食蟹猴帕金森模型

單側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈注射MPTP誘導(dǎo)食蟹猴帕金森參考文獻(xiàn)進(jìn)行[3]。3只用于造模的實(shí)驗(yàn)猴(編號(hào)為00231，00235，00238)通過(guò)右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈注射MPTP，動(dòng)物造模1.5年后，日常觀察顯示動(dòng)物左側(cè)上肢較少抓取食物，且注射阿樸嗎啡后出現(xiàn)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈的癥狀，進(jìn)一步通過(guò)PET-CT確認(rèn)動(dòng)物右側(cè)多巴胺能神經(jīng)元損傷后，應(yīng)用于本研究。

(2)電凝法制備食蟹猴單側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模型

電凝法制備食蟹猴單側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模型參考文獻(xiàn)進(jìn)行[4]。1只實(shí)驗(yàn)猴(編號(hào)為1931)通過(guò)開(kāi)顱手術(shù)，電凝法閉塞左側(cè)大腦中動(dòng)脈，動(dòng)物干預(yù)6個(gè)月后，日常觀察顯示動(dòng)物右側(cè)上肢較少抓取食物，且右側(cè)肢體活動(dòng)異常，進(jìn)一步通過(guò)MRI確認(rèn)動(dòng)物左側(cè)大腦出現(xiàn)缺血性梗死灶后，應(yīng)用于研究。

1.2.2 測(cè)試方法

(1)實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

挑選健康的實(shí)驗(yàn)猴，頭部姿勢(shì)端正，無(wú)身體震顫、麻痹癥狀，無(wú)視覺(jué)缺陷癥狀，四肢發(fā)育正常，無(wú)骨折、變性及骨關(guān)節(jié)炎等癥狀。實(shí)驗(yàn)猴進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，每天通過(guò)食物引誘方式，建立實(shí)驗(yàn)人員與猴的互動(dòng)關(guān)系。當(dāng)實(shí)驗(yàn)猴能很快從實(shí)驗(yàn)人員的手上獲取食物，不產(chǎn)生恐懼感時(shí)，實(shí)驗(yàn)猴可以開(kāi)展評(píng)價(jià)試驗(yàn)。

(2)實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)前，實(shí)驗(yàn)猴應(yīng)禁食一餐或給予平時(shí)食量的三分之一。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，先將實(shí)驗(yàn)猴放入評(píng)價(jià)裝置中適應(yīng)，并將食物放入第一層階梯上，訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)猴能通過(guò)樹(shù)脂玻璃面板上的狹窄通道迅速?gòu)碾A梯上取走食物。

在山階梯任務(wù)中，將食物放在單側(cè)山階梯上，讓實(shí)驗(yàn)猴單手拿取食物，計(jì)時(shí)3 min，計(jì)時(shí)結(jié)束后，查看每層食物拿取情況，記錄相應(yīng)分?jǐn)?shù)，每天左右側(cè)分別進(jìn)行3次測(cè)試，并將3次得分相加得到當(dāng)天測(cè)試的分?jǐn)?shù)，連續(xù)測(cè)定10 d。

在谷階梯任務(wù)中，將食物放在單側(cè)谷階梯上，讓實(shí)驗(yàn)猴單手拿取食物,計(jì)時(shí)3 min，計(jì)時(shí)結(jié)束后，查看每層拿取食物情況，記錄相應(yīng)分?jǐn)?shù)，每天左右側(cè)分別進(jìn)行3次測(cè)試，并將3次得分相加得到當(dāng)天測(cè)試的分?jǐn)?shù)，連續(xù)測(cè)定10 d。

山階梯和谷階梯任務(wù)從低到高每層階梯對(duì)應(yīng)的分?jǐn)?shù)為1、2、3、4、5分，實(shí)驗(yàn)猴通過(guò)相應(yīng)側(cè)的手拿到食物才能計(jì)分，如沒(méi)有通過(guò)相應(yīng)的手則不計(jì)分。每天測(cè)試總分為45分，最終根據(jù)10 d測(cè)定的平均分?jǐn)?shù)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)猴單側(cè)上肢的運(yùn)動(dòng)功能。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 正常食蟹猴山和谷測(cè)試結(jié)果

用于山和谷測(cè)試的3只正常實(shí)驗(yàn)猴(編號(hào)：1312203，11040305，11021311)左右手抓取食物能力基本一致。經(jīng)過(guò)山階梯任務(wù)試驗(yàn)測(cè)試，左手抓取左側(cè)和右手抓取右側(cè)階梯上的食物得分都為45分。經(jīng)過(guò)谷階梯任務(wù)試驗(yàn)測(cè)試，左手抓取右側(cè)和右手抓取左側(cè)階梯上的食物得分都為45分(圖3)。結(jié)合山和谷階梯任務(wù)試驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明3只正常實(shí)驗(yàn)猴空間識(shí)別和運(yùn)動(dòng)功能未出現(xiàn)異常。

2.2 單側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈注射MPTP誘導(dǎo)食蟹猴帕金森模型測(cè)試結(jié)果

實(shí)驗(yàn)猴右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈注射MPTP所致右側(cè)大腦損傷(編號(hào)：00231，00235，00238)引起左手的抓取食物異常。山和谷測(cè)試前，通過(guò)PET-CT分子影像檢測(cè)顯示3只待測(cè)實(shí)驗(yàn)猴右側(cè)黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元損傷(圖4，黑色箭頭所示)。山階梯任務(wù)試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果顯示，3只猴左手抓取左側(cè)階梯上的食物得分分別為0分，2分，1.1分；右手抓取右側(cè)階梯上的食物得分分別為2.7分，27.6分，27.2分。谷階梯任務(wù)試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果顯示，3只猴左手抓取右側(cè)階梯上的得分分別為0分，10.1分，0分；右手抓取左側(cè)階梯上的食物得分分別為4.1分，32.6分，30分(圖5)。結(jié)合山和谷階梯任務(wù)試驗(yàn)結(jié)果，表明編號(hào)為00235，00238的實(shí)驗(yàn)猴造模后出現(xiàn)左手運(yùn)動(dòng)功能損傷，空間識(shí)別能力基本正常，而編號(hào)為00231的實(shí)驗(yàn)猴造模后不僅出現(xiàn)左手運(yùn)動(dòng)能力損傷，可能也存在空間識(shí)別能力異?；蛴沂诌\(yùn)動(dòng)能力損傷。

圖3 正常實(shí)驗(yàn)猴山和谷階梯任務(wù)試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果Figure 3 Evaluation results for normal experimental monkeys in hill and valley staircase tasks

2.3 電凝法制備單側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞食蟹猴模型測(cè)試結(jié)果

實(shí)驗(yàn)猴左側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞所致的左側(cè)大腦損傷引起右手抓取食物異常。山和谷測(cè)試前，通過(guò)MRI檢測(cè)顯示編號(hào)為1931的實(shí)驗(yàn)猴猴手術(shù)后左側(cè)大腦出現(xiàn)典型的缺血梗死灶(圖6，白色箭頭所示)。山階梯任務(wù)試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果顯示，1931實(shí)驗(yàn)猴左手抓取左側(cè)階梯上的食物得分為43.5分，右手抓取右側(cè)階梯上的食物得分為0分；谷階梯任務(wù)試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果顯示，1931實(shí)驗(yàn)猴左手抓取右側(cè)階梯上的食物得分為45分，右手抓取左側(cè)階梯上的食物得分為0分(圖7)。結(jié)合山和谷試驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明該猴的實(shí)驗(yàn)干預(yù)導(dǎo)致右手運(yùn)動(dòng)功能損傷，空間識(shí)別能力基本正常。

圖4 利用18F-L-DOPA進(jìn)行PET-CT顯像表明3只帕金森猴右側(cè)黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元損傷(黑色箭頭)Figure 4 18F-fluoro-L-DOPA PET-CT images showing the impairment of dopaminergic neurons in right substantia nigra of three PD monkeys (Black arrow)

注：與對(duì)側(cè)上肢比較，**P< 0.01。圖5 單側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈注射MPTP誘導(dǎo)帕金森食蟹猴山和谷階梯任務(wù)試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果Note. Compared with the contralateral upper limb, **P< 0.01.Figure 5 Evaluation results of the hill and valley staircase tasks for PD monkeys induced by injecting MPTP into unilateral internal carotid artery

圖6 MRI顯像表明實(shí)驗(yàn)猴左側(cè)大腦出現(xiàn)缺血梗死灶(白色箭頭)Figure 6 MRI images showing ischemic infarction in the left brain of experimental monkeys (White arrow)

注：與對(duì)側(cè)上肢比較，**P<0.01。圖7 單側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞食蟹猴山和谷階梯任務(wù)試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果Note. Compared with the contralateral upper limb, **P<0.01.Figure 7 Evaluation results of hill and valley staircase tasks for ischemic stroke monkey induced by unilateral middle cerebral artery occlusion

3 討論

在機(jī)體運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，大腦根據(jù)外界刺激產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)意向，明確運(yùn)動(dòng)的方向或行為方式，但是，大腦不對(duì)運(yùn)動(dòng)的程序、指令進(jìn)行分析，而是由紋狀體、小腦參與完成。當(dāng)大腦聯(lián)絡(luò)區(qū)產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)意向后，紋狀體、小腦根據(jù)運(yùn)動(dòng)意向分析產(chǎn)出運(yùn)動(dòng)樣本，調(diào)動(dòng)紋狀體、小腦控制、指揮運(yùn)動(dòng)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，山和谷階梯任務(wù)試驗(yàn)已報(bào)道應(yīng)用于單側(cè)損傷的帕金森和腦梗等猴疾病模型的運(yùn)動(dòng)功能和藥效評(píng)價(jià)[5-8]。為此，我們依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，設(shè)計(jì)改造了山和谷階梯任務(wù)試驗(yàn)評(píng)價(jià)裝置，其中，山階梯任務(wù)試驗(yàn)裝置評(píng)價(jià)空間感知和運(yùn)動(dòng)的腦區(qū)均位于大腦同側(cè)，谷階梯任務(wù)試驗(yàn)裝置評(píng)價(jià)空間感知和運(yùn)動(dòng)的腦區(qū)分別大腦對(duì)側(cè)，通過(guò)對(duì)不同實(shí)驗(yàn)猴腦疾病模型的應(yīng)用評(píng)價(jià)，為腦疾病研究提供合適、有效的行為評(píng)價(jià)方法。

對(duì)于正常實(shí)驗(yàn)猴，主管大腦意識(shí)的大腦額葉、頂枕顳聯(lián)絡(luò)區(qū)和主管運(yùn)動(dòng)的紋狀體和小腦沒(méi)有受損。因此，動(dòng)物在山和谷階梯任務(wù)試驗(yàn)中，左右手均獲得較高的分?jǐn)?shù)，表明正常動(dòng)物能夠順利完成上述測(cè)試，儀器功能正常。

對(duì)于MPTP誘導(dǎo)的帕金森實(shí)驗(yàn)猴，通過(guò)PET-CT檢測(cè)，顯示右側(cè)紋狀體區(qū)多巴胺能神經(jīng)元損傷后，3只帕金森實(shí)驗(yàn)猴在山階梯任務(wù)試驗(yàn)都顯示左手的得分較低，說(shuō)明左側(cè)腦意識(shí)和左側(cè)腦運(yùn)動(dòng)功能損傷。在谷階梯任務(wù)試驗(yàn)中，3只實(shí)驗(yàn)猴都顯示左手右側(cè)的得分較低，說(shuō)明左側(cè)腦意識(shí)和右側(cè)腦運(yùn)動(dòng)的損傷。結(jié)合損傷部位，3只帕金森的右側(cè)腦運(yùn)動(dòng)區(qū)受到了損傷。由于模型制作是通過(guò)右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈注射MPTP，可能存在大腦其他區(qū)域的損傷，所以其中1只動(dòng)物顯示出左右手功能缺陷，暫時(shí)無(wú)法確定是否存在右側(cè)意識(shí)的損傷。

對(duì)于大腦中動(dòng)脈閉塞損傷猴模型，通過(guò)MRI影像檢測(cè)，顯示實(shí)驗(yàn)猴左側(cè)大腦存在缺血梗死灶，所以動(dòng)物在山階梯任務(wù)試驗(yàn)中顯示右手的得分較低，說(shuō)明右側(cè)腦意識(shí)和右側(cè)腦運(yùn)動(dòng)功能損傷。在谷階梯任務(wù)實(shí)驗(yàn)中該猴右手左側(cè)得分較低，說(shuō)明右側(cè)腦意識(shí)和左側(cè)腦運(yùn)動(dòng)的損傷，手術(shù)干預(yù)損傷了左側(cè)大腦中動(dòng)脈，因此該猴的左側(cè)腦運(yùn)動(dòng)區(qū)受到損傷。

通過(guò)對(duì)正常實(shí)驗(yàn)猴和不同的模型猴進(jìn)行山和谷階梯任務(wù)試驗(yàn)評(píng)價(jià)，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)?zāi)苡行?yīng)用于單側(cè)腦損傷的運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)。