浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 杭州 310053

近年來(lái)，隨著人們生活水平提高，高蛋白、高嘌呤等食物攝入增多，加上飲酒、焦慮、疲勞等因素，使得體內(nèi)尿酸濃度呈不斷升高趨勢(shì)，尿酸鹽結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)處，最終引起痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（gouty arthritis，GA）[1]。GA具有反復(fù)發(fā)作、疼痛劇烈等特點(diǎn)，尤其是急性期所致的關(guān)節(jié)疼痛及關(guān)節(jié)破壞，給患者日常生活帶來(lái)了很大障礙[2]。

研究表明，在痛風(fēng)發(fā)展的病理過(guò)程中，除代謝因素外，炎癥與免疫機(jī)制也參與發(fā)病[3]。Nod樣受體蛋白3（Nod-like receptor pyrin domain 3，NLRP3）炎性體軸和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路是誘發(fā)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的重要通路，該兩條通路的激活最終會(huì)導(dǎo)致白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等炎癥因子的大量釋放，是引起痛風(fēng)急性發(fā)作的關(guān)鍵因素[4-7]。因此，以NLRP3炎性體軸和NF-κB信號(hào)通路為切入點(diǎn)，開(kāi)發(fā)治療GA的新藥具有重要意義。

目前臨床上使用的抗GA藥物（秋水仙堿、非甾體類(lèi)抗炎藥物等），存在白細(xì)胞減少、再生障礙性貧血、肝損害等不良反應(yīng)，不適宜長(zhǎng)期服用。而中藥在GA的治療方面具有一定優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)隨著現(xiàn)代中醫(yī)藥的發(fā)展，研究已證實(shí)有很多自擬方，或者以經(jīng)方、成方為基礎(chǔ)進(jìn)行加減的中藥方劑治療GA效果良好[8-10]。本研究在經(jīng)典方三妙丸基礎(chǔ)上，配伍除濕、解毒、通利關(guān)節(jié)的土茯苓（Smilax glabra Roxb.），組成加味三妙丸（modified Sanmiao pill，MSMP），探討其 GA 的作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞 人源單核白血病細(xì)胞株THP-1由中科院上海細(xì)胞庫(kù)提供。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司(批號(hào)：1914970)；β-巰基乙醇、MTT 購(gòu)于美國(guó) Amresco公司（批號(hào)：M0482100、1755C459）；雙抗、RPMI 1640 培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（phosphote buffered saline，PBS）購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司（批號(hào)：J170027、AD23107271、AC11223329）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）購(gòu)于北京Solarbio公司（批號(hào)：818E0312）；秋水仙堿購(gòu)于上海阿拉丁公司（批號(hào)：G1514018）；尿酸鈉（monosodium urate，MSU）、佛波酯（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate，PMA） 購(gòu)于美國(guó) Sigma-Aldrich 公司（批號(hào)：BC8R7559、SLBS0478V）；人 IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司（批號(hào)：165998051）；髓樣分化因子 88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、NF-κB p65、磷酸化 NF-κB p65（phospho-NF-κB p65，p-NF-κB p65）、NF-κB 抑制蛋白 α(inhibitor of NF-κB α，IκBα）、磷酸化IκBα（phospho-IκBα，p-IκBα）、磷酸化 IκB 激酶 α（phospho-inhibitor of NF-κB kinase α，p-IKKα）、NLRP3抗體均購(gòu)于Cell Signaling Technology公司（批號(hào)：3、16、10、18、19、9、3）；抗 Toll樣受體 2（Tolllike receptor 2，TLR2）、抗 TLR4、抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，caspase-1）、抗含CARD結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)顆粒樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC）抗體均購(gòu)于abcam公司（批號(hào)：GR3182784-1、GR308811-8、GR202191-1、2813878）。

1.1.3 主要儀器 Power Blotter XL半干轉(zhuǎn)膜儀、HH-2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司；Synergy H1型多功能微孔板檢測(cè)儀、Mini-PROTEAN Tetra System垂直電泳儀購(gòu)于美國(guó)BioTek公司；5427R型低溫離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司；Odyssey Clx雙色紅外激光成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)LICOR公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋購(gòu)于常州國(guó)華電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物的制備 土茯苓、黃柏、蒼術(shù)、川牛膝購(gòu)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司，鑒定后按照本課題組方法自制，其中土茯苓：黃柏：蒼術(shù)：川牛膝=3:3:2:1，提取物符合指紋圖譜質(zhì)控要求[11]。精密稱(chēng)取MSMP凍干粉1g，以10mL含10%體積分?jǐn)?shù)二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的PBS超聲溶解，濃度為100mg·mL-1，作為保存液，以0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后，分裝，-20℃避光保存。臨用前以培養(yǎng)基稀釋。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) THP-1細(xì)胞采用含10%胎牛血清、0.05mmol·L-1β-巰基乙醇及 1%雙抗的 RPMI 1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3d傳代1次。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 將THP-1細(xì)胞以5×104/mL的數(shù)量接種于96孔板中，每孔加入50ng·mL-1PMA，誘導(dǎo)24h使細(xì)胞貼壁，PBS洗滌后，在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，加入0.05～1.0mg·mL-1系列濃度的MSMP，分別作用12h或24h后棄去上清液，每孔加入200μL MTT溶液，培養(yǎng)4h后棄去，每孔加150μL DMSO，以空白孔調(diào)零，充分震蕩，490nm處檢測(cè)吸光度，計(jì)算各組細(xì)胞存活率。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 將細(xì)胞分為空白組、模型組、秋水仙堿組和MSMP低、中、高劑量組。將THP-1細(xì)胞以5×105/mL的數(shù)量接種于6孔板中，每孔加入50ng·mL-1PMA，誘導(dǎo)24h使細(xì)胞貼壁，以PBS洗滌，除空白組外其余各組用1μg·mL-1LPS刺激24h，經(jīng)PBS洗滌兩次后，分別加入0.1μmol·L-1秋水仙堿和0.1、0.2、0.4mg·mL-1MSMP，然后分別加入 MSU，使終濃度為10mg·mL-1，刺激3h。收集各組細(xì)胞上清液或細(xì)胞裂解液，用于各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。

1.2.5 ELISA檢測(cè)THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β的水平 取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-1β水平。

1.2.6 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 取細(xì)胞裂解液，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。每泳道上樣蛋白20μg，SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入一抗，4℃封閉過(guò)夜，TBST洗滌3次，每次5min，加入二抗，孵育2h后，TBST洗滌3次，每次5min，以O(shè)dyssey Clx雙色紅外激光成像系統(tǒng)采集信息并攝取圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度MSMP對(duì)細(xì)胞存活率影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MSMP對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響，說(shuō)明毒性較小、作用溫和。給藥處理24h后，MSMP劑量在0.05～0.4mg·mL-1時(shí)，細(xì)胞存活率均大于90%。見(jiàn)表1。因此以0.1、0.2、0.4 mg·mL-1作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中MSMP的劑量。

2.2 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β水平比較 與空白組比較，模型組IL-1β水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，MSMP低、中、高劑量組IL-1β水平均顯著降低（P＜0.01），且具有劑量依賴(lài)性。見(jiàn)圖1。

表1 不同濃度MSMP對(duì)細(xì)胞存活率的影響（±s，%）Tab.1 Effect of different concentrations of MSMP on cell viability(±s，%)

表1 不同濃度MSMP對(duì)細(xì)胞存活率的影響（±s，%）Tab.1 Effect of different concentrations of MSMP on cell viability(±s，%)

MSMP 濃度（mg·mL-1） 12h 24h 0 0.05 0.1 0.2 0.4 0.8 1.0 100 99.72±0.23 99.73±0.27 97.60±0.13 97.41±0.05 96.46±0.12 94.71±0.03 100 93.12±0.06 93.31±0.12 93.14±0.07 92.88±0.03 86.42±0.11 80.38±0.09

圖1 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β水平比較Fig.1 Comparison of level of IL-1β of culture supernatant in each group

2.3 各組細(xì)胞 MyD88、TLR2、TLR4蛋白表達(dá)比較與空白組比較，模型組MyD88、TLR2和TLR4蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，MSMP中、高劑量組MyD88、TLR2和TLR4蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；MSMP 低劑量組 TLR2、TLR4的蛋白表達(dá)低于模型組（P＜0.05），MyD88蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖 2。

圖2 各組細(xì)胞MyD88、TLR2、TLR4蛋白表達(dá)比較Fig.2 Comparison of expression of MyD88,TLR2 and TLR4 protein in each group

2.4 各組細(xì)胞NF-κB炎癥信號(hào)通路磷酸化蛋白表達(dá)比較 與空白組比較，模型組p-NF-κB p65、p-IκBα、p-IKKα 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，MSMP 中、高劑量組 p-NF-κB p65、p-IκBα、p-IKKα 蛋白顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）；MSMP 低劑量組p-NF-κB p65和p-IKKα蛋白表達(dá)降低（P＜0.01，P＜0.05），p-IκBα 蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖3。

2.5 各組細(xì)胞NLRP3炎性體軸蛋白表達(dá)比較 與空白組比較，模型組NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，MSMP低、中、高劑量組NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達(dá)下降（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)圖 4。

3 討論

圖3 各組細(xì)胞NF-κB炎癥信號(hào)通路磷酸化蛋白表達(dá)比較Fig.3 Comparison of expression of phosphorylated proteins of NF-κB signaling pathway in each group

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為痛風(fēng)屬“痹癥”范疇，最主要的病因是“濁瘀痹”，即脾腎虧虛、濕濁、痰濁及瘀血，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物積聚于關(guān)節(jié)、軟組織及軟骨，從而引發(fā)體內(nèi)一系列炎癥反應(yīng)[12]。因此，治療痛風(fēng)的關(guān)鍵在于清熱祛濕、活血化瘀、疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)補(bǔ)脾腎等。根據(jù)中醫(yī)治療原則，本課題組研發(fā)了MSMP，方中土茯苓、黃柏為君，解毒除濕、通利關(guān)節(jié)；蒼術(shù)為臣，燥濕健脾；川牛膝為使，逐瘀通經(jīng)，全方符合中醫(yī)治療GA的治則?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，土茯苓、黃柏等藥物中黃酮類(lèi)與生物堿類(lèi)化合物具有良好的抗痛風(fēng)、抗炎作用[13-16]。

圖4 各組細(xì)胞NLRP3炎性體軸相關(guān)蛋白表達(dá)比較Fig.4 Comparison of expression of NLRP3 inflammasome axis protein in each group

GA發(fā)病過(guò)程中伴隨著諸多信號(hào)通路的激活或抑制，其中NLRP3炎性體軸在許多急性和慢性炎癥中處于中心地位[17]，MSU結(jié)晶被吞噬進(jìn)入細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中的NLRP3炎性復(fù)合體同時(shí)被激活。除上述激活途徑外，內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs） 也能促進(jìn) NLRP3炎性體、ASC與caspase-1前體相互作用，促使caspase-1前體從復(fù)合物中裂解，形成具有活性的caspase-1[18]。隨后，活化的caspase-1促進(jìn)IL-1β生成并釋放到細(xì)胞外，IL-1β的異常分泌導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，或者加重原有的炎癥反應(yīng)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，MSMP能明顯下調(diào)NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達(dá)，降低IL-1β水平，這表明MSMP能通過(guò)下調(diào)NLRP3炎性體軸相關(guān)蛋白及caspase-1的表達(dá)，從而抑制IL-1β釋放，防止GA急性發(fā)作。

研究表明，MSU作為DAMPs能夠被細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)的病原識(shí)別受體（如TLR2、TLR4等）識(shí)別，MyD88可為T(mén)LRs傳遞信號(hào)，在MSU誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)中，MyD88是必不可少的轉(zhuǎn)接蛋白[20]。TLRs與病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMPs）結(jié)合后，與MyD88的羧基末端相互作用，使MyD88活化。此外，在GA等炎癥模型中，NF-κB對(duì)炎性因子的釋放起到關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，NF-κB二聚體在細(xì)胞質(zhì)中與IκBα結(jié)合而以無(wú)活性狀態(tài)存在，受到刺激后，IκBα開(kāi)始被IKKα磷酸化，而后迅速降解，釋放活化的p-NF-κB，后者進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與DNA結(jié)合，啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄，刺激機(jī)體產(chǎn)生、釋放白細(xì)胞介素-1β前體（pro-interleukin-1β，pro-IL-1β）[21-24]。本研究結(jié)果表明，在 THP-1 細(xì)胞中，MyD88活化后能夠激活NF-κB，進(jìn)而促進(jìn)pro-IL-1β釋放。MSMP能明顯抑制IL-1β相關(guān)受體激酶的活化，從而下調(diào)TLR2、TLR4及NF-κB炎癥信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，減少pro-IL-1β釋放，而且該機(jī)制與對(duì)NLRP3炎性體軸的抑制形成協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)一步抑制IL-1β的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗GA的作用。

綜上所述，本研究證實(shí)MSMP通過(guò)抑制NLRP3炎性體軸和NF-κB信號(hào)通路，從而協(xié)同抑制IL-1β等炎性因子釋放，是其治療GA的重要分子機(jī)制。