馮華煒，艾海新,2，楊天舟，齊夢(mèng)園，譚燕妮，麻麗丹，劉宏生,2,*

（1.遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036；2.遼寧省生物大分子模擬計(jì)算與信息處理工程研究中心，遼寧 沈陽(yáng) 110036；3.丹東出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 丹東 118000）

食源性甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）和諾如病毒（norovirus，NoV）（基因型I（GI）和II（GII））可以引起人類非細(xì)菌性胃腸炎或傳染性肝炎，甚至導(dǎo)致死亡，是全世界重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1-2]。HAV屬微小核糖核酸病毒科（Picornaviridae），NoV屬杯狀病毒科（Caliciviridae）。HAV和NoV均屬單股正鏈RNA病毒，無(wú)包膜，主要通過(guò)糞-口途徑傳播，也可通過(guò)人-人接觸傳播，或通過(guò)受污染的水和食物進(jìn)行傳播[3-6]。食源性HAV和NoV具有低劑量感染（10～100 顆粒[7]）和強(qiáng)傳染性等傳播特性，其中，HAV和NoV在糞便中的顆粒數(shù)可達(dá)106～1012個(gè)/g[8-9]，1 個(gè)NoV顆粒引起的感染率可達(dá)50%，超過(guò)了已報(bào)導(dǎo)的任何一種食源性病毒[10]。此外，食源性HAV和NoV還具有很高的環(huán)境適應(yīng)性，在低溫下可存活數(shù)月[11-12]，在60 ℃和68 ℃的高溫下可分別存活30 min和20 min[13]，對(duì)高壓、低pH值以及某些消毒劑也具有一定抵抗力[14-15]。通常，這兩種病毒可以通過(guò)煮沸快速失活，因此，生的或未煮熟食物極易成為傳播食源性HAV和NoV的載體。

草莓、樹莓、藍(lán)莓等小漿果被譽(yù)為“第三代”水果，因含有豐富的保健營(yíng)養(yǎng)成分，受到廣大消費(fèi)者的青睞[16]。但是，隨著全球小漿果消費(fèi)量的持續(xù)增長(zhǎng)[17]，新鮮和冷凍小漿果中與食源性HAV和NoV有關(guān)的感染事件也在逐年上升。據(jù)調(diào)查，1983—2014年間，歐洲范圍內(nèi)與冷凍小漿果有關(guān)的HAV和NoV污染事件分別達(dá)到1 400 起和32 起[18-19]。2012年，德國(guó)發(fā)生了全球最大規(guī)模的食源性NoV感染冷凍草莓事件，感染人數(shù)達(dá)10 952 人，涉及到400多所學(xué)校和日托中心，使得小漿果這一食源性病毒傳播載體得到了全世界的高度重視[20]。在對(duì)該次爆發(fā)事件的污染來(lái)源調(diào)查中，相關(guān)研究的病毒回收率僅在0%～1%之間[21]，暴露出受污染小漿果在食源性病毒檢測(cè)中存在缺陷。

為確保小漿果類食品的安全，本文擬從以下3 個(gè)方面進(jìn)行綜述：1）調(diào)查食源性HAV和NoV在小漿果中的流行狀況，為甲型肝炎和腹瀉性疾病的爆發(fā)預(yù)警提供數(shù)據(jù)；2）提出食源性HAV和NoV的提取和核酸檢測(cè)方法的最新知識(shí)，為完善食源性HAV和NoV的檢測(cè)方法提供思路；3）闡述檢測(cè)過(guò)程控制在食源性病毒檢測(cè)中的應(yīng)用情況，為準(zhǔn)確評(píng)估檢測(cè)結(jié)果、合理解釋檢測(cè)數(shù)據(jù)提供幫助。

1 與小漿果有關(guān)的HAV和NoV的流行狀況

小漿果靠近地表面生長(zhǎng)，無(wú)法運(yùn)用機(jī)械采摘，極易受氣候條件、灌溉水、土壤環(huán)境、采摘人員的影響[9]。新鮮小漿果極易腐爛，通常不進(jìn)行清洗或消毒處理[22]，具有潛在的污染風(fēng)險(xiǎn)。此外，某些食源性病毒可與小漿果表面的土著微生物（如Bacillus spp.、Erwinia spp.、Pseudomonas spp.）分泌的胞外聚合物進(jìn)行特異性結(jié)合，進(jìn)一步增強(qiáng)了它們的污染能力[23]。大量的研究表明，小漿果已成為傳播食源性病毒的重要媒介[19]，其中食源性NoV和HAV為污染小漿果的兩種重要病原菌[18,24]。

圖1 1988—2017年RASFF數(shù)據(jù)庫(kù)中HAV和NoV的在小漿果中的爆發(fā)和分布情況[29]Fig. 1 Outbreak and distribution of HAV and NoV in berries based on RASFF database from 1988 to 2017[29]

在歐洲，第一例小漿果中HAV和NoV的感染事件分別發(fā)生于1983年[25-26]和1987年[27]。根據(jù)食品與飼料快速預(yù)警系統(tǒng)（rapid alert system for food and feed，RASFF）的數(shù)據(jù)[28-29]（圖1），在1998—2017年間，歐盟小漿果中污染NoV的通告數(shù)達(dá)69 條，污染HAV的通告數(shù)達(dá)9 條，污染呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)。作為歐洲小漿果的主要生產(chǎn)國(guó)，2013—2014年間意大利因HAV污染小漿果引發(fā)的病例數(shù)達(dá)到1 803 起[5]。由于HAV和NoV在冷凍后仍具有完整基因和結(jié)構(gòu)，因此在所有受污染的小漿果產(chǎn)品中，冷凍類型的漿果成為潛在的高風(fēng)險(xiǎn)食物，如冷凍樹莓的污染占所有農(nóng)產(chǎn)品的23.7%[9-10,28]。1998年，第一例與小漿果有關(guān)的HAV和NoV感染事件分別發(fā)生于美國(guó)的艾奧瓦州和得克薩斯州[30]。根據(jù)美國(guó)疾病與預(yù)防控制中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）的數(shù)據(jù)[30]（圖2），1988—2016年間，HAV和NoV在小漿果中爆發(fā)達(dá)22 次，導(dǎo)致673 人患病，67 人住院。其中，2013年爆發(fā)的HAV污染小漿果事件規(guī)模最大，涉及美國(guó)十幾個(gè)州，感染人員達(dá)150 人，住院人數(shù)比例達(dá)44%[9]。在所有污染的食物中，小漿果混合食物（如含小漿果的沙拉或甜點(diǎn)）占主要位置，其次為小漿果單獨(dú)引起的污染，如HAV和NoV在草莓中引起的感染次數(shù)分別為2 次和3 次[30]。

圖2 1998—2016年美國(guó)小漿果產(chǎn)品中的HAV和NoV引起的食源性疾病[30]Fig. 2 Outbreak of foodborne diseases caused by HAV and NoV in American berry products from 1998 to 2016[30]

在中國(guó)，食源性HAV和NoV已成為威脅人們健康的巨大隱患。從“大中華食品安全信息庫(kù)”（http://kwanlab.bio.cuhk.edu.hk/FS/）[31-32]中搜索的結(jié)果顯示（圖3），2006—2017年間，關(guān)于食源性NoV和HAV的新聞和論文分別為278 條和43 條，其中，2013—2015年廣東省NoV爆發(fā)了52 次[33]，2014—2016年青島市食源性NoV爆發(fā)了23 次[34]。國(guó)內(nèi)食源性HAV和NoV的溯源調(diào)查顯示，貝類產(chǎn)品為主要的污染源，小漿果作為污染源的數(shù)據(jù)很少[35-36]。但是，這并不能說(shuō)明我國(guó)的小漿果產(chǎn)品是安全的，房保海等[37]對(duì)果蔬產(chǎn)品（216 份）中HAV的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果顯示，小漿果產(chǎn)品的陽(yáng)性率占到了1.85%。根據(jù)1998—2017年RASFF的通報(bào)數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)出口小漿果污染NoV達(dá)8 例，引發(fā)的食物中毒爆發(fā)3 次，反映出我國(guó)小漿果具有潛在的病毒感染風(fēng)險(xiǎn)[29]?，F(xiàn)有研究狀況顯示，由于病毒檢測(cè)技術(shù)不成熟，無(wú)法對(duì)具有潛在污染的高風(fēng)險(xiǎn)食品進(jìn)行檢測(cè)，從而給中國(guó)小漿果產(chǎn)品的污染監(jiān)測(cè)和評(píng)估帶來(lái)困難[34]。

圖3 中國(guó)食源性HAV和NoV的發(fā)生情況[32]Fig. 3 Occurrence of foodborne HAV and NoV infections in China[32]

2 小漿果中食源性病毒的檢測(cè)方法

2.1 病毒提取方法

2.1.1 病毒洗脫-濃縮法

在食源性病毒的提取方法中，基于病毒洗脫-濃縮的方法在小漿果中得到廣泛應(yīng)用，其中堿性洗脫結(jié)合聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）沉淀的方法應(yīng)用最廣。病毒洗脫-濃縮法主要包括兩個(gè)關(guān)鍵步驟：1）從食品基質(zhì)中洗脫釋放病毒；2）從洗脫液中濃縮病毒。

完整的病毒洗脫是保證病毒顆粒完整提取的重要基礎(chǔ)。在小漿果樣品的病毒洗脫過(guò)程中，大量果膠的存在會(huì)抑制小漿果樣品中病毒的提取效率，在草莓中加入果膠酶可將HAV的檢測(cè)靈敏度提高3 倍[38]，在含藍(lán)莓的沙拉中加入果膠酶可將NoV GI和NoV GII的回收率提高2～6 倍[39]。不同洗脫液在食源性病毒檢測(cè)中應(yīng)用效果已有評(píng)估[38,40]（表1），常用洗脫液為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（International Organization for Standardization，ISO）/歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)中的Tris-甘氨酸-牛肉浸提物洗脫液（Tris-glycine-beef extract，TGBE）[21,38-39,41]，在該洗脫液中，Tris可以保持洗脫液的緩沖能力，甘氨酸用來(lái)減少病毒顆粒對(duì)食物成分的非特異性吸附。王飛等[42]的研究表明Tralk洗脫液在草莓中的洗脫效果優(yōu)于TGBE洗脫液和NaOH洗脫液。也有研究指出，食品表面產(chǎn)生的氣泡有助于病毒粒子在食品表面進(jìn)行充分釋放，進(jìn)而提高病毒的洗脫效率[43-44]。Summa等[45]認(rèn)為以碳酸鹽為基礎(chǔ)的緩沖液可以在樹莓表面形成氣泡，對(duì)NoV具有更高的洗脫效率。研究表明，聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）可有效去除小漿果中的多酚物質(zhì)。Hida等[46]在TGBE洗脫液中加入PVP，使得葡萄中鼠諾如病毒-1（murine norovirus 1，MNV-1）的回收率提高了5 倍。

洗脫后的病毒顆粒存在于大體積的洗脫液中，對(duì)病毒濾液進(jìn)行濃縮以獲得高濃度、高純度的完整病毒顆粒對(duì)于之后的核酸提取極其重要。盡管有研究表明超濾法[39]和超速離心法[46]在病毒的濃縮中具有良好的病毒回收率，但從總體來(lái)看，具有高親水性的高分子聚合物PEG，可以通過(guò)吸收洗脫液中的水分來(lái)減少病毒之間的距離，對(duì)食源性病毒具有更好的濃縮效果[21,41,47-48]。但在食源性病毒提取過(guò)程中，PEG沉淀法會(huì)產(chǎn)生許多與病毒無(wú)關(guān)的小分子物質(zhì)沉淀，對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制效應(yīng)[49-50]。Bartsch等[41]在PEG沉淀病毒后采用MobiSpin S-400 columns對(duì)冷凍草莓中NoV提取物進(jìn)行抑制劑去除，NoV GI的檢出率從22.3%提升至59.1%，NoV GII的檢出率從40.1%提高至90.9%，有效提高了TGBE-PEG沉淀法的提取效率。

2.1.2 直接提取病毒法

表1 不同病毒提取方法的比較Table 1 Comparison of different virus extraction methods

病毒洗脫-濃縮法通常較為復(fù)雜，尤其是針對(duì)容易釋放大量酸性物質(zhì)的小漿果時(shí)，需對(duì)洗脫液的pH值進(jìn)行反復(fù)調(diào)節(jié)，同時(shí)進(jìn)行多次孵育來(lái)釋放病毒，完成病毒提取所需的理論時(shí)間大約為150 min。目前，直接向小漿果樣品表面添加裂解液的病毒提取方法得到了一定應(yīng)用（表1），具體步驟為：1）樣品中添加裂解液，室溫孵育5 min；2）室溫條件下15 000×g離心5 min，提取病毒RNA。該法操作步驟簡(jiǎn)單，將病毒提取時(shí)間縮短了15 倍，具有很好的病毒提取效率。Perrin等[51]采用該法對(duì)樹莓樣品進(jìn)行檢測(cè)，病毒回收率為46.2%，顯著高于病毒洗脫-濃縮法（20.3%）。Summa等[45]對(duì)直接提取病毒法進(jìn)行了改良，即收集1 mL的解凍樹莓汁液后加入250 μL PEG/NaCl溶液（含50 g、100 mL PEG 8000、1.5 mol/L NaCl）進(jìn)行沉淀，該法對(duì)9 份自然污染的冷凍樹莓（100 拷貝數(shù)）進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，NoV GII.4的陽(yáng)性檢出率可達(dá)44.4%，提取效率（32%）高于病毒洗脫-濃縮法（24%）。受抑制物的影響，直接提取病毒法仍無(wú)法應(yīng)用于其他類型小漿果的檢測(cè)，該法在草莓中的病毒提取率僅為0.52%[41]。

2.2 病毒檢測(cè)方法

2.2.1 RT-PCR方法

采用非特異性的置入染料或者特異性探針在“實(shí)時(shí)”方式下檢測(cè)病毒RNA的實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）法是食源性HAV和NoV檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，廣泛應(yīng)用于草莓、樹莓、藍(lán)莓等小漿果樣品的檢測(cè)[16,39,54]。在食源性HAV的檢測(cè)過(guò)程中，高度保守的5’NCRs是設(shè)計(jì)HAV引物探針的理想?yún)^(qū)域[55-61]（圖4）。目前，很多食源性HAV操作規(guī)程都依據(jù)該區(qū)域設(shè)計(jì)RTPCR引物和探針[62-64]，最佳的RT-PCR引物探針對(duì)已被納入ISO標(biāo)準(zhǔn)。開放式閱讀框(ORF)1-ORF2連接區(qū)域是NoV最保守的區(qū)域，對(duì)NoV所有的基因型具有高水平的核酸序列一致性[49,65-66]（圖5），這個(gè)特征使得(ORF)1-ORF2成為設(shè)計(jì)NoV實(shí)時(shí)RT-PCR引物的理想?yún)^(qū)域[16,62-63]。在食源性NoV的檢測(cè)過(guò)程中，不同的實(shí)驗(yàn)室采用不同的方法、不同的樣本，都會(huì)影響實(shí)時(shí)RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果。此外，NoV的高度變異性及持續(xù)進(jìn)化性也會(huì)影響NoV的檢測(cè)靈敏性[67]；因此，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和修訂實(shí)時(shí)RT-PCR中的引物探針就變得極其重要。Yoo等[68]對(duì)常用的4 種NoV GII和NoV GII引物探針對(duì)進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果表明在探針中加入ZEN猝滅劑后可有效增加病毒的檢測(cè)靈敏度，同時(shí)降低PCR檢測(cè)過(guò)程中的背景信號(hào)。

圖4 HAV基因組的示意圖以及在HAV檢測(cè)和基因分型中常用的引物和探針的位置[55-61]Fig. 4 Schematic diagram of HAV genome and location of primers and probes commonly used in HAV detection and genotyping[55-61]

在單重定量RT-PCR（RT-quantitative PCR，RT-qPCR）法中，一個(gè)樣本在檢測(cè)不同的病毒時(shí)，檢測(cè)所需的核酸量取決于待檢病毒的種類，檢測(cè)效率較低，不適用于檢測(cè)食源性疾病爆發(fā)中的稀有樣品。在同一反應(yīng)管中進(jìn)行多重病毒檢測(cè)的多重實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)（multiplex RT-PCR，MRT-PCR）的應(yīng)用進(jìn)一步提高了病毒的檢測(cè)效率，與單重RT-qPCR相比，MRT-PCR可縮短50%的檢測(cè)時(shí)間，顯著降低試劑耗材費(fèi)用。但是受PCR熒光檢測(cè)通道的影響，病毒在MRT-PCR擴(kuò)增過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生相互抑制作用，在NED、FAM和VIC熒光通道中，草莓樣品中HAV、NoV GI和NoV GII的檢測(cè)靈敏度分別為31.4 CCID50/20 g、56.2 RT-PCR50/20 g和31.6 RT-PCR50/20 g[69]。為了解決這種缺陷，微流體定量PCR（microfluidic quantitative PCR，MFQPCR）技術(shù)進(jìn)一步得以發(fā)展。在MFQPCR技術(shù)中，一個(gè)芯片上可以同時(shí)進(jìn)行多個(gè)納升級(jí)（10-12L）的qPCR，例如，一個(gè)96.96 Dynamic Array芯片上可同時(shí)進(jìn)行9 216 個(gè)qPCR，可對(duì)96 個(gè)樣品中的96 種病毒同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)[70]。Ishii等[71]采用MFQPCR技術(shù)對(duì)11 種腸道病毒進(jìn)行了檢測(cè)，并從污水中檢測(cè)出NoV GI、NoV GII和輪狀病毒。Oshiki等[72]采用MFQPCR技術(shù)對(duì)臨床和食品中的11 種腸道病毒進(jìn)行分型，該法在牡蠣中的檢測(cè)靈敏度為102～105拷貝數(shù)/g。目前，MFQPCR技術(shù)在食源性腸道病毒的高通量檢測(cè)與分型中得以應(yīng)用，在小漿果的食源性病毒調(diào)查中應(yīng)用較少。

2.2.2 數(shù)字PCR方法

基于相對(duì)基因組定量的RT-qPCR方法需要采用標(biāo)準(zhǔn)品（DNA或RNA）進(jìn)行校準(zhǔn)，定量結(jié)果容易產(chǎn)生偏差，對(duì)弱陽(yáng)性樣本（Ct值≥40）難以進(jìn)行定量，且存在嚴(yán)重的RT-PCR抑制效應(yīng)[73-75]。采用微量核酸直接測(cè)定基因拷貝數(shù)的數(shù)字RT-PCR（digital RT-PCR，dRT-PCR）技術(shù)可以解決這一缺陷[76]。dRT-PCR方法通過(guò)將樣本（微升體積）稀釋分配到微流體芯片或微液滴中，采用與RT-qPCR相同的引物和探針進(jìn)行大量單獨(dú)的熒光PCR擴(kuò)增，使得每個(gè)反應(yīng)中包含1 個(gè)或0 個(gè)目標(biāo)核酸拷貝數(shù)，最后通過(guò)泊松分布計(jì)算原始樣本中核酸的拷貝數(shù)[77]。目前，dRT-PCR技術(shù)主要應(yīng)用于細(xì)菌性食源微生物的定量檢測(cè)，少量應(yīng)用于食源性腸道病毒的定量檢測(cè)[78-79]。由于dRT-PCR是在RT-PCR終點(diǎn)進(jìn)行陽(yáng)性擴(kuò)增的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，對(duì)小漿果中的RT-PCR抑制物具有更高的耐受性。Fraisse等[80]對(duì)冷凍草莓、冷凍樹莓和冷凍混合莓進(jìn)行dRT-PCR和RT-qPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示dRT-PCR（0%～96%）的抑制效率顯著低于RT-qPCR（4%～77%），過(guò)程控制在dRT-PCR反應(yīng)體系中無(wú)需進(jìn)行10 倍體積稀釋。此外，dRT-PCR具有較高的檢測(cè)靈敏度，在草莓樣品中NoV的檢測(cè)限為185 拷貝數(shù)/25 g，高于RT-qPCR法的257 拷貝數(shù)/25 g[81]。在檢測(cè)低水平拷貝數(shù)樣品時(shí)精確度和重復(fù)性更優(yōu)，適用于混合感染小漿果食物及其加工制品中的食源性病毒檢測(cè)，但是dRT-PCR法的最低檢測(cè)限在低污染小漿果中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值尚需進(jìn)一步驗(yàn)證[80]。2.2.3 下一代測(cè)序技術(shù)

圖5 NoV基因組的示意圖以及在NoV檢測(cè)和基因分型中常用的引物和探針的位置[49,65-66]Fig. 5 Schematic diagram of NoV genome and location of primers and probes commonly used in NoV detection and genotyping[49,65-66]

基于PCR的方法擴(kuò)增片段較?。ㄐ∮?00 bp），且高度依賴引物探針，因此不能區(qū)分食源性病毒的感染性與非感染性，對(duì)病毒的基因分析也受到一定限制[82]。利用下一代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）對(duì)病毒的宏基因組進(jìn)行分析，不僅有利于對(duì)食源性致病菌達(dá)到分子水平上的整體深入認(rèn)識(shí)，同時(shí)也給食源性病毒的快速檢測(cè)提供了更靈敏、更特異的技術(shù)可能。NGS的原理類似于Sanger測(cè)序，即在DNA模板重新合成一個(gè)片段的過(guò)程中，對(duì)每一個(gè)小片段DNA的堿基序列的實(shí)時(shí)識(shí)別。NGS以一種大規(guī)模并行的方式將這個(gè)過(guò)程擴(kuò)展到數(shù)百萬(wàn)個(gè)反應(yīng)中，實(shí)現(xiàn)了病毒全基因組的高通量快速測(cè)序。在合適的測(cè)序深度下（食源性病毒基因組較小，測(cè)序結(jié)果中注釋到病毒的序列較少，所需測(cè)序深度可達(dá)上百倍），NGS可以完成食品樣品中常見和罕見的NoV變異序列的分析[83]。Imamura等[84]采用NGS技術(shù)對(duì)日本牡蠣中NoV的多樣性進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)5 種NoV基因型（GII.3、GII.4、GII.13、GII.16和GII.17），同時(shí)區(qū)分了NoV的感染性與非感染性。NGS技術(shù)還具有很高的靈敏度，可以從人工污染的芹菜檢測(cè)出低于103拷貝數(shù)的HAV和NoV[85]。作為一種無(wú)目標(biāo)的方法，NGS技術(shù)可用于食源性疾病爆發(fā)事件的污染源調(diào)查。Bartsch等[81]采用該技術(shù)對(duì)2012年德國(guó)爆發(fā)NoV感染事件中的冷凍草莓進(jìn)行檢測(cè)，成功檢測(cè)出2 株NoV（NoV GII.P16和NoV GII.13）。目前的研究表明，測(cè)序過(guò)程中產(chǎn)生大量與植物相關(guān)的序列（87.06%）使得與病毒相關(guān)的序列（0.01%）相對(duì)較少，是目前限制NGS用于小漿果中食源性病毒檢測(cè)的障礙。未來(lái)仍需通過(guò)各種方法對(duì)NGS技術(shù)進(jìn)行完善，例如通過(guò)樣品的DNases處理去除測(cè)序過(guò)程中產(chǎn)生干擾序列。

3 檢測(cè)過(guò)程控制

基于PCR的方法在食源性病毒的檢測(cè)中分為3 個(gè)步驟：1）病毒提??；2）病毒RNA提?。?）RT-PCR檢測(cè)。在病毒檢測(cè)過(guò)程中，抑制效應(yīng)發(fā)生于各個(gè)檢測(cè)階段。首先，食品樣品基質(zhì)中存在大量的RT-PCR抑制物會(huì)影響食源性病毒的有效提取，如小漿果中存在的果膠、鞣質(zhì)酸會(huì)影響病毒的濃縮；其次，病毒RNA提取過(guò)程中提取試劑、食品基質(zhì)成分的殘留同樣會(huì)對(duì)RT-PCR產(chǎn)生抑制作用，如來(lái)自小漿果中的酚類、多糖物質(zhì)，可隨病毒RNA的提取共同被提取出，對(duì)RT-PCR擴(kuò)增造成干擾[86]；最后，RT-PCR檢測(cè)中，RNA提取試劑的殘留、引物探針和酶的質(zhì)量也會(huì)影響病毒的擴(kuò)增效率。針對(duì)各檢測(cè)階段中抑制物的去除方法已有大量研究[87-88]，如RT-PCR擴(kuò)增前使用One-StepTMPCR Inhibitor Removal Kit去除抑制劑。但是沒有一種方法能夠徹底去除病毒檢測(cè)中存在的抑制物質(zhì)，因此需在病毒檢測(cè)過(guò)程中建立完善的質(zhì)量控制（過(guò)程控制），來(lái)判定病毒檢測(cè)結(jié)果的可靠性。依據(jù)添加位置的不同，過(guò)程控制被分為3 個(gè)類型（圖6）：1）全程過(guò)程控制（whole process controls，WPCs）：在病毒提取前加入；2）分子過(guò)程控制（molecular process controls，MPCs）：在核酸提取前加入；3）RT-PCR控制：在RT-PCR擴(kuò)增前加入。另外，過(guò)程控制的提取效率需滿足一定的水平，通常將病毒RNA的提取效率分為3 個(gè)水平：低（小于1%）、可接受（1%～10%）和良好（超過(guò)10%）[89]。當(dāng)RNA提取效率小于1%時(shí)，需重新進(jìn)行病毒富集或病毒RNA的提取。

圖6 過(guò)程控制在食源性病毒檢測(cè)過(guò)程中的應(yīng)用框架圖Fig. 6 Framework of process controls used for virus detection in foods

3.1 全程過(guò)程控制

在確定目標(biāo)病毒的提取效率時(shí)，在樣本中加入一定量的過(guò)程控制可以反映目標(biāo)病毒的回收效率。這種過(guò)程控制的回收率既受濃縮效率的影響，也受RNA提取效率和RT-PCR的影響。因此接種于樣品中的過(guò)程控制是一個(gè)典型的WPCs?？膳囵B(yǎng)的病毒顆粒是評(píng)估食源性病毒提取效率的理想WPCs（表2），這些病毒與待檢目標(biāo)病毒具有相似的形態(tài)、遺傳、環(huán)境持久性，更不會(huì)出現(xiàn)在待檢的污染樣品中[48,90]。WPCs在食源性HAV和NoV檢測(cè)中的應(yīng)用研究顯示，WPCs和目標(biāo)病毒的相關(guān)性主要取決于食品基質(zhì)的類型。如MNV可以有效指示NoV GI和NoV GII在小漿果中的回收率[91]，但不能指示瓶裝水或半干番茄中NoV GI的回收率[92]。同一WPCs在不同類型的食品中也具有不同的回收率，如MNV在草莓中的回收率為（20.69±2.89）%，在樹莓中的回收率卻為（17.36±1.57）%[39,93]。此外，病毒提取過(guò)程中發(fā)生的大量損失也是影響WPCs回收率的主要原因之一。不同WPCs的損失位置也有很大差異，MNV-1和MS2噬菌體的損失主發(fā)生在病毒濃縮過(guò)程中，杜蘭病毒（Tulane virus，TV）的損失發(fā)生在病毒洗脫和濃縮過(guò)程中[94]。在指示目標(biāo)病毒的提取效率時(shí)，WPCs的加入量應(yīng)大于或等于WPCs在待檢樣品中的檢測(cè)限。例如，當(dāng)MNV-1在瓶裝水、西紅柿和生菜中的檢測(cè)限分別為106、107、108拷貝數(shù)時(shí)，該WPCs在樣品中添加量應(yīng)大于108拷貝數(shù)[92]。

3.2 分子過(guò)程控制

WPCs的指示效率容易受下游操作的影響（如病毒RNA提取和RT-PCR擴(kuò)增中存在的抑制效應(yīng)），從而導(dǎo)致同一WPCs在相同的樣品中表現(xiàn)出不同的提取效率，因此針對(duì)不同檢測(cè)階段采取不同的過(guò)程控制極為重要。在提取好的病毒沉淀或溶液中加入一定量的MPCs進(jìn)行共同提?。ㄔ禡PCs與10 倍體積稀釋的Ct值之差在3.3左右[95]），可以有效指示病毒RNA提取過(guò)程中發(fā)生的抑制效應(yīng)。WPCs的添加量需進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估，含量過(guò)高會(huì)抑制目標(biāo)病毒，含量過(guò)低會(huì)降低檢測(cè)限。研究表明，MS2的含量為104拷貝數(shù)/mL時(shí)，對(duì)目標(biāo)病毒的影響可以忽略不計(jì)[96]。

基于基因相似的病毒具有相似的核酸提取效率的理論，門哥病毒（Mengo virus，MgV）常用來(lái)指示食源性HAV的RNA提取效率[62-64,92,97]。在ISO標(biāo)準(zhǔn)中，MgV也被用作指示食源性NoV RNA提取效率的MPCs[62-63]。此外，MNV和TV也是小漿果樣品中檢測(cè)NoV常用的MPCs[98]。但是，MNV和NoV在臨床表現(xiàn)、宿主受體發(fā)病機(jī)制和感染的細(xì)胞類型等方面還有一些差別[99]。由于MNV的功能受體為唾液酸[100]，而NoV的功能受體為組織血型抗原（histo-blood group antigens，HBGA）[101]，因此能夠識(shí)別A型和B型HBGA作為受體進(jìn)行感染的TV似乎更適合作為NoV的MPCs[102]。作為過(guò)程控制的天然病毒具有致病性，對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件有很高的要求，因此采用包被特定病毒基因的裝甲R(shí)NA技術(shù)得到發(fā)展，其中采用該技術(shù)構(gòu)建的MS2噬菌體樣病毒顆粒得到廣泛應(yīng)用，可以對(duì)食源性HAV和NoV的RNA提取和濃縮效率進(jìn)行有效控制[96]。

與相似理論不同的是，基因相似的MPCs似乎不能一直具有相同的核酸提取效率，核酸的提取效率多取決于待檢病毒類型及待檢食品類型。Hennechart-Collette等[92]的研究表明，MNV-1適用于檢測(cè)瓶裝水、西紅柿和生菜中的HAV，不適于檢測(cè)瓶裝水和生菜中的NoV GI和NoV GII，而MgV更適用于檢測(cè)瓶裝水和生菜中的NoV GI和NoV GII。因此，在實(shí)際檢測(cè)工作中，需針對(duì)不同類型的食品基質(zhì)，采用不同的MPCs進(jìn)行核酸提取效率的監(jiān)控。

3.3 RT-PCR過(guò)程控制

在RT-PCR階段，核酸反轉(zhuǎn)錄的平均效率僅為20%[103]，同一個(gè)RT-qPCR反應(yīng)也會(huì)出現(xiàn)不同的擴(kuò)增效率，因此在含有WPCs的核酸溶液中加入特定的DNA或RNA，是評(píng)估目標(biāo)病毒RT-PCR抑制效應(yīng)的有效方法。當(dāng)RT-PCR過(guò)程控制的抑制指數(shù)小于2.0時(shí)，表明WPCs具有良好的提取效率，也表明RT-PCR擴(kuò)增效果良好[90]。在食源性病毒的檢測(cè)中，各種類型的DNA或RNA可以作為RT-PCR過(guò)程控制（表2）。其中，靶病毒的DNA質(zhì)?；騌NA序列經(jīng)常被用作RT-PCR控制[104-106]，這種控制可以和目標(biāo)病毒采用相同的引物和探針進(jìn)行檢測(cè)。但是，當(dāng)反應(yīng)體系中存在抑制物質(zhì)時(shí)，過(guò)程控制和目標(biāo)病毒在同一反應(yīng)管的擴(kuò)增效率就很難準(zhǔn)確計(jì)算。此外，使用該類RT-PCR控制容易引起待檢核酸樣品的污染，導(dǎo)致“假陽(yáng)性”檢測(cè)結(jié)果的產(chǎn)生。此外，在PCR反應(yīng)體系中加入外部擴(kuò)增控制也可以指示RT-PCR的抑制效應(yīng)。該類過(guò)程控制與目的基因序列共用同一對(duì)擴(kuò)增引物，通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物大小或熒光標(biāo)記與靶病毒進(jìn)行區(qū)分，避免了在PCR反應(yīng)體系中多對(duì)引物間的相互作用，可用小漿果樣品中病毒RT-PCR抑制效應(yīng)的監(jiān)測(cè)[64,80]。

表2 食源性HAV和NoV檢測(cè)過(guò)程中常用的過(guò)程控制類型Table 2 Types of process controls used in the detection of foodborne HAV and NoV

4 結(jié) 語(yǔ)

食源性HAV和NoV引發(fā)的小漿果產(chǎn)品感染已成為全球重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，而且已經(jīng)有愈演愈烈的趨勢(shì)。流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，受污染小漿果主要集中于歐盟地區(qū)，感染類型為草莓和樹莓，由于檢測(cè)技術(shù)的限制在中國(guó)少有報(bào)道統(tǒng)計(jì)。然而，已有的資料僅僅是冰山一角，由于缺乏合適的檢測(cè)方法對(duì)低劑量病毒感染的食物進(jìn)行的檢測(cè)，使得50%的病毒引起的食源性感染不為人們所知[111]，這意味著小漿果產(chǎn)品中食源性病毒的快速檢測(cè)仍然面臨巨大的挑戰(zhàn)。針對(duì)爆發(fā)的食源性HAV和NoV污染物的檢測(cè)結(jié)果顯示，HAV和NoV在小漿果中分布不均勻，同一批次樣品存在比例不同的陰性和陽(yáng)性樣本，進(jìn)一步加大了食源性病毒檢測(cè)檢測(cè)難度[49]，而國(guó)際權(quán)威的ISO標(biāo)準(zhǔn)只對(duì)檢測(cè)所需的取樣量進(jìn)行規(guī)定，缺乏小漿果批次產(chǎn)品的采樣標(biāo)準(zhǔn)[62-63]。因此，建立可靠的采樣標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法是解決污染小漿果產(chǎn)品農(nóng)產(chǎn)品中低劑量HAV和NoV不均勻分布的問(wèn)題的有效途徑。

在食源性HAV和NoV的檢測(cè)中，病毒提取、核酸檢測(cè)和檢測(cè)過(guò)程控制是三大關(guān)鍵因素。在病毒提取中，洗脫-濃縮法成為常規(guī)提取方法，在洗脫緩沖液中加入PVP、果膠酶等物質(zhì)可以減少食品基質(zhì)效應(yīng)的影響，利用食品表面產(chǎn)生的氣泡充分釋放吸附于食品表面的病毒顆粒，采用直接提取病毒RNA法在特定漿果中也有一定應(yīng)用，但是如何盡可能地去除提取過(guò)程中產(chǎn)生的抑制物質(zhì)、完善病毒提取方法的適用性仍然面臨挑戰(zhàn)。在核酸檢測(cè)方面，基于PCR的方法是食源性病毒檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其中，單重RT-qPCR和MRT-qPCR方法檢測(cè)效率低，不適用于大樣本的檢測(cè)；MFQPCR可以實(shí)現(xiàn)小漿果產(chǎn)品中食源性病毒的高通量檢測(cè)與分型，但是盡可能地去除PCR抑制物質(zhì)仍然是研究人員需要努力的方向；絕對(duì)定量的數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)抑制物的耐受性強(qiáng)于RT-qPCR方法，具有很高的靈敏度，適用于高抑制劑食物的無(wú)標(biāo)定量檢測(cè)，但是該法的最低檢測(cè)限在弱陽(yáng)性小漿果樣本中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值還需進(jìn)一步驗(yàn)證；采用NGS技術(shù)對(duì)病毒宏基因組進(jìn)行分析，不但可以實(shí)現(xiàn)未知病毒的定量檢測(cè)與分型，還可以判斷病毒的感染性，已在NoV的病毒學(xué)監(jiān)測(cè)[112]和環(huán)境監(jiān)測(cè)[113]中得到一定應(yīng)用，是最有前景的食源性病毒分析方法之一，但是有效去除干擾序列是下一步所期待解決的問(wèn)題。在檢測(cè)過(guò)程中評(píng)估病毒回收率的過(guò)程控制可分為3 種類型：WPCs、MPCs和RT-PCR控制，也有各種類型的過(guò)程控制應(yīng)用于各個(gè)檢測(cè)階段，但迄今為止還未建立既可用于控制又能保持適當(dāng)回收率的過(guò)程控制“金標(biāo)準(zhǔn)”；其次，在評(píng)估檢測(cè)過(guò)程的整體性能時(shí)，不僅需要考慮單個(gè)樣本的回收率，更要考慮樣本的平均回收率，才可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確解釋；最后，利用裝甲R(shí)NA技術(shù)構(gòu)建非致病性的病毒樣顆?？梢詫?duì)病毒的檢測(cè)效率進(jìn)行指示，但在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，仍需考慮病毒樣顆粒對(duì)目標(biāo)病毒的適用性。

源頭控制是食源性疾病防控的一個(gè)重要手段，通過(guò)建立可靠的采樣標(biāo)準(zhǔn)和良好的檢測(cè)方法，可以快速溯源爆發(fā)中可疑的污染源。此外，建立小漿果食源性HAV和NoV爆發(fā)數(shù)據(jù)庫(kù)，利用大數(shù)據(jù)分析方法建立食源性HAV和NoV爆發(fā)預(yù)測(cè)模型，從時(shí)間、空間、生產(chǎn)鏈等方面對(duì)小漿果產(chǎn)品中可能發(fā)生的食源性病毒感染進(jìn)行精準(zhǔn)預(yù)測(cè)，進(jìn)而從源頭上防控食源性HAV和NoV病毒的爆發(fā)和感染。