姜曉潔 姜曉

CRISPR/Cas9的發(fā)展及在基因組編輯中的應(yīng)用

姜曉潔①姜曉②*

（①山東省海陽市動物疫病預防與控制中心 265100 ②山東省海陽市留格莊鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站）

CRISPR/Cas9系統(tǒng)為研究基因的功能和疾病的發(fā)生提供了一種簡單有效的基因操作工具。CRISPR/Cas9由一個非特異性的Cas9核酸酶和一組可編輯的序列特異性CRISPR-RNA(crRNA)組成，而crRNA能夠指導Cas9蛋白在靶位點使DNA產(chǎn)生雙鍵斷裂從而線性化DNA。隨后胞內(nèi)的DNA修復過程導致了靶向位點DNA的插入，刪除和替代。CRISPR/Cas9介導的DNA線性化的特異性受到crRNA序列配對和靶向位點上游PAM區(qū)的影響。本文將介紹CRISPR/Cas9在基因組編輯中的機制及未來在基因編輯和臨床治療中的應(yīng)用。

DNA的重組和操作技術(shù)在過去的60年有了重大的發(fā)展。這個發(fā)展開始于DNA雙螺旋的發(fā)現(xiàn)，隨后DNA的化學合成及檢測技術(shù)為研究基因功能建立了基礎(chǔ)。酶切和PCR技術(shù)的發(fā)展為基因的擴增及其在體外，細胞和模式動物的突變提供了一種可行的方法。隨后，基因組測序技術(shù)及產(chǎn)生的不同物種的整個的基因組數(shù)據(jù)在過去20年有了長足的發(fā)展。近幾年，起源于細菌的獲得性免疫系統(tǒng)的CRISPR/Cas9技術(shù)為轉(zhuǎn)化生物學提供了穩(wěn)定的基因組編輯技術(shù)。

1 基因組編輯技術(shù)的發(fā)展

自從DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)之后，研究者便致力于研究細胞和微生物中基因堿基位點的特異性突變[1]。許多基因組編輯技術(shù)的早期方法主要依賴于基因組序列位點特異性的識別方法。細菌和酵母的天然的DNA修復和重組途徑揭示了細胞中DNA雙鍵斷裂后自我修復的分子機制。因此，細胞中DNA的斷裂為基因組的打靶提供了一種可行的方案[2-5]。早期的DNA靶向線性化的方法主要依賴于寡聚核苷酸和小分子對DNA堿基對的修復識別。隨后，基因組編輯中內(nèi)含子的自我剪切為位點特異性的DNA線性化和整合提供了一種新的思路[6, 7]。大約在同一時間，ZFNs(Znic-Finger Nulcease,鋅指核酸酶)介導了模式化的DNA識別蛋白產(chǎn)生，當這個蛋白與限制性內(nèi)切酶Fok I識別的特異性結(jié)構(gòu)域結(jié)合時，在特異性的位點能夠造成DNA序列的有效斷裂，而ZFNs技術(shù)在果蠅和哺乳動物細胞染色體中的識別被證明是有效的[8-9]。盡管ZFNs技術(shù)對某些實驗中的基因編輯技術(shù)是完全有效的，但其在任意位點設(shè)計和證明的難度決定了其不能廣泛地應(yīng)用于物種的基因組編輯中。隨后，與ZFNs原理類似的TALENs (Transcri-ption activator–like effectors)技術(shù)的應(yīng)用能夠耦合Fok I內(nèi)切酶從而造成DNA特異性位點的斷裂[10-12]。相對于ZFNs技術(shù)，TALENs在基因組編輯中更靈活和有效，但是蛋白設(shè)計合成的難度仍然是制約其發(fā)展的一個重要原因。

2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)展

（1）CRISPRs系統(tǒng)首先在大腸桿菌基因組中被發(fā)現(xiàn)，隨后在多數(shù)的細菌和古生菌中被發(fā)現(xiàn)并預言了其在DNA修復和調(diào)控中的可能機制[13-14]。在2005年一個重要的發(fā)現(xiàn)證明CRISPRs的基因間隔序列都從病毒的質(zhì)粒分化而來，同時明確了編碼核酸酶和解旋酶相關(guān)的Cas基因蛋白[15]。2007年，噬菌體感染乳酸嗜熱鏈球菌的實驗證明了CRISPR/Cas系統(tǒng)介導的獲得性免疫，這個發(fā)現(xiàn)也證明了CRISPR/Cas存在于牛奶生產(chǎn)工藝中的細菌中，而這些細菌的存在能夠有效地控制噬菌體帶來的污染[16]。2008年，成熟的CRISPR RNAs能夠作為Cas蛋白的向?qū)Ц蓴_影響大腸桿菌的病毒的分化。同時，在表皮葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)了CRISPR/ Cas系統(tǒng)介導的DNA靶向剪切活性[17-18]。（2）功能性的CRISPR是由CRISPR陣列重復，DNA靶向序列間隔以及編碼crRNA組分和Cas蛋白操縱子的組分構(gòu)成[19]。自然環(huán)境下，病毒能夠通過CRISPR間隔序列與細菌發(fā)生匹配，而病毒能夠在CRISPR介導的毒力減弱過程中不斷發(fā)生變化。獲得性免疫的發(fā)生由三個階段組成[20]：第一個階段是病毒的DNA短序列作為CRISPR系統(tǒng)的基因間隔序列插入；第二個階段是crRNA前體的產(chǎn)生和成熟并最終產(chǎn)生個體識別的crRNAs；而第三個階段則是Cas蛋白和tracrRNA或crRNA介導的外源核酸序列的線性化。在整個的過程中，三種CRISPR/Cas系統(tǒng)均能夠使外源DNA的產(chǎn)生線性化[21-22]。在這三種CRISPRs系統(tǒng)中，I型的和III型的都利用一個大的Cas蛋白對crRNA進行靶向的剪切，而II型的CRISPR系統(tǒng)則僅僅利用一個單獨的Cas蛋白進行RNA介導的DNA識別和線性化[23, 24]，這對于基因組的編輯應(yīng)用具有重要的意義。

3 CRISPR/Cas 9的功能

（1）Cas9的生物信息學分析表明其擁有兩個潛在的酶切結(jié)構(gòu)域，分別是HNH結(jié)構(gòu)域和RuvC結(jié)構(gòu)域[25]，前期的研究表明嗜熱鏈球菌的Cas9對于抵御病毒的入侵有重要的作用，其作用的機理可能是介導了入侵的質(zhì)粒和噬菌體基因組的雙鍵斷裂(DSBs)[26]。而在此過程中，HNH結(jié)構(gòu)域和RuvC結(jié)構(gòu)域能夠影響外源質(zhì)粒的降解效率。（2）而與序列特異性相關(guān)的成熟的crRNA則受到II型的CRISPR/Cas9蛋白上游tracrRNA(轉(zhuǎn)錄激活crRNA)調(diào)控。成熟的crRNA對于RNA介導的靶向位點DNA的內(nèi)切有重要的作用。Cas9蛋白的HNH結(jié)構(gòu)域能夠與crRNA中的20個核苷酸互補從而使序列線性化。而RuvC結(jié)構(gòu)域則能夠線性化DNA的另一條互補鏈[23]。HNH結(jié)構(gòu)域和RuvC結(jié)構(gòu)域的單獨突變會造成單鏈DNA單鏈的斷裂活性，然而HNH結(jié)構(gòu)域和RuvC結(jié)構(gòu)域的同時突變會形成RNA介導的DNA連接蛋白。外源DNA的識別需要靶序列上游與crRNA的配對的短序列和毗鄰靶序列的PAM同時存在[23, 24]圖1)。（3）實際應(yīng)用中，crRNA被編輯成具有先導作用的sgRNA。而sgRNA保留了兩個重要的特征，其5’端的20bp核苷酸序列決定了DNA的識別位點，而與其互補的3’序列能夠與Cas9結(jié)合。sgRNA的這個簡單的雙分系統(tǒng)能夠利用CRISPR/Cas系統(tǒng)編輯任何毗鄰PAM的序列[23]。與ZNFs系統(tǒng)和TALENs系統(tǒng)不同，CRISPR/Cas系統(tǒng)對DNA的編輯僅僅是需要sgRNA的改變。基于此原因，CRISPR系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于基因組的打靶、編輯和修飾過程中。

圖1：CRISPR/Cas9 II型系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和生物學功能

A.CRISPR/Cas9系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和操縱單元 B.CRISPR/Cas系統(tǒng)介導的主動防御及外源DNA的斷裂和降解 C：TracrRNA和crRNA介導的DNA線性化過程[1]

4 CRISPR/Cas9介導的基因組打靶的機制

（1）分子結(jié)構(gòu)觀察表明Cas9通過先導RNA與靶向DNA結(jié)合時，其分子構(gòu)象會發(fā)生重排變化。這種變化會使Cas9蛋白完全包裹RNA-DNA的結(jié)合位點。而Cas9蛋白的兩翼則被富含精氨酸的α螺旋所橋接，而這種結(jié)構(gòu)對于RNA介導的DNA突變位點的識別有重要的意義[27, 28]。因此，Cas9分子構(gòu)象的改變可能是RNA靶向定位DNA分子的一個重要原因。而PAM的存在對于DNA的識別同樣有重要的意義，缺少了PAM結(jié)構(gòu)域，即使先導RNA序列能夠和靶序列完全匹配，Cas9蛋白也不能識別。Cas9蛋白與先導鏈RNA和靶點DNA形成的晶體結(jié)構(gòu)證明PAM位于堿基配對的DNA結(jié)構(gòu)內(nèi)[29]。Cas9蛋白C末端的精氨酸模體結(jié)構(gòu)域與非互補鏈的PAM結(jié)構(gòu)域均位于Cas9兩個基團形成的大溝內(nèi)。而靶向DNA的磷酸二酯與位于小溝內(nèi)的PAM相互作用導致位于PAM上游的靶向DNA鏈的形成解鏈結(jié)構(gòu)(R-loop)[30]。單分子的實驗證明R-loop的結(jié)合速度主要受PAM的影響，而其穩(wěn)定性則主要由PAM上游的間隔序列決定。綜上，靶向DNA的解鏈開始于PAM的識別，最終導致R-loop結(jié)構(gòu)的形成，伴隨著RNA的侵入最終形成RNA-DNA的雜交結(jié)構(gòu)(圖2)。（2）為評估CRISPR /Cas9在細胞中與靶位點的結(jié)合能力，研究者用高通量測序和免疫共沉積技術(shù)確定了Cas9在基因組中連接位點的數(shù)量和類型。結(jié)果表明在人和小鼠的細胞中，Cas9能夠與基因組上與sgRNA配對的許多非激活位點結(jié)合[31, 32]。而Cas9與這些脫靶位點的結(jié)合主要受到PAM結(jié)構(gòu)域和配對的先導鏈RNA序列的影響。激活的Cas9不能線性化脫靶位點的DNA序列表明了其活性與靶位點DNA的結(jié)合能力，序列配對有重要的聯(lián)系。另外，相對于緊縮的染色體結(jié)構(gòu)，Cas9蛋白與開放的染色體的結(jié)合能力更強(圖2)。

圖2 Cas9蛋白的結(jié)構(gòu)和功能[37]。tracrRNA和sgRNA介導的Cas9蛋白對DNA靶位點的識別

5 Cas9蛋白靶向識別的忠實性

Cas9酶能夠通過RuvC和HNH的酶切結(jié)構(gòu)域?qū)邢駾NA切成平末端的雙鍵斷裂(DSB)的DNA。Cas9蛋白能夠通過RuvC和HNH酶切結(jié)構(gòu)域的點突變使DNA產(chǎn)生單鏈的斷裂(SSB)。而單鏈DNA的非同源末端修復(NHEJ)相對于基因重組修復(HR)有更高的忠誠性。為了提高DSB修復的忠誠性，一種類似于ZNFs和TALENs高忠誠性修復的方法被發(fā)現(xiàn)[33, 34]，應(yīng)用成對的sgRNAs和Cas9 (HNH+/RuvC-結(jié)構(gòu)域)突變體(D10A)能夠有效的提高DNA雙鏈中的插入缺失效率，這種方法能夠產(chǎn)生具有粘性末端的雙鍵斷裂，當外源同源臂和目的基因存在時，基因的同源重組修復能夠使目的基因有效的插入到突變點。而這種DNA雙鍵斷裂的方案在sgRNA過短或者存在錯配過多，其脫靶性顯著的增加[35]。而sgRNA的合適設(shè)計和Cas9的合理使用會顯著的提高其忠實性。

6 CRISPR/Cas9在細胞編輯中的應(yīng)用

（1）從CRISPR系統(tǒng)被證明能夠有效的編輯人類細胞開始，經(jīng)過人工改造的Cas9蛋白和人類設(shè)計的sgRNAs以及tracrRNA被證明能在人的胚胎干細胞，小鼠的細胞中共表達。在靶向的位點產(chǎn)生了靶向的DNA雙鍵斷裂(DSBs)，從而激活了RNA介導的DNA非同源末端的基因修復和基因的替換。同時多重的基因打靶也被證明具有可行性。這項技術(shù)與TALENs和ZNFs技術(shù)相比，其基因編輯的效率能達到80%[36-38]。（2）迄今為止，Cas9蛋白已經(jīng)廣泛的有效的應(yīng)用于多個物種和細胞系的基因編輯中，這些物種包括人類的細胞系，細菌，酵母，斑馬魚，小鼠，豬和猴子[39, 40]。同時，Cas9也能引起同一物種的不同基因的突變。Cas9能夠與crRNA和tracr RNA，sgRNAs配對到靶位點，而影響Cas9活性的主要因素則是位于靶位點下游的PAM區(qū)。與早期的Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用所不同的是，sgRNA上游增加48bp長度的tracrRNA會形成更高水平的NHEJ(非同源末端連接)。增加的tracrRNA對于sgRNA的穩(wěn)定性以及Cas9-sgRNA-DNA的末端復合物的形成具有重要作用。這種設(shè)計表明sgRNA的結(jié)構(gòu)對于Cas9的活性起重要的作用[41-43]。（3）CRISPR/Cas系統(tǒng)的共性是通過改變不同的pre-crRNA，其能同時線性化許多共同的靶位點，利用其這個特點能夠有效的同時干擾多個基因的表達。事實上，Cas9基因和多重的sgRNA的共表達能夠在哺乳動物細胞中形成有效的基因編輯。

7 Cas9在細胞和動物模型建立中的應(yīng)用

（1）Cas9蛋白現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用于不同物種的靶向基因編輯中，而Cas9的靶向定位能夠大規(guī)模實現(xiàn)基因組的干擾從而有利于檢測基因的功能或者闡明基因的可變剪切。另外，野生型的Cas9能夠通過抑制催化結(jié)構(gòu)域的激活從而轉(zhuǎn)變成RNA介導的生物學工具。而Cas9與調(diào)控元件模塊的融合則能夠提高Cas9在基因編輯中的效率[37]。（2）Cas9介導的加速了轉(zhuǎn)基因細胞和動物模型的建立。通過患病體細胞的基因突變，CRISPR/ Cas9能夠快速的建立疾病的細胞模型，同時能夠利用ES和IPS細胞疾病模型實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因動物模型的建立[37]。（3）在細胞模型的建立中，可以通過轉(zhuǎn)染攜帶有sgRNA質(zhì)粒和Cas9蛋白實現(xiàn)的基因打靶模型的建立。此外，Cas9的多重功能能夠為人類的普通疾病提供可行的解決方案。大規(guī)模的基因組分析能夠評估疾病帶來的風險，然而，疾病是由哪種可變剪切引起無法預料，利用Cas9蛋白則能夠探測出可變剪切對基因功能的影響[38]。（4）在動物模型的建立中，編輯好的sgRNA和Cas9 可以通過原核注射的方法注入到受精卵中實現(xiàn)遺傳基因的修飾。這種方法減少了利用體細胞核移植技術(shù)制造轉(zhuǎn)基因動物的時間和成本。而獼猴模型的多基因的打靶動物的出生表明了人類疾病可以通過靈長類動物建立模型。另外，Cas9在體細胞中的直接應(yīng)用避免了胚胎的操作同時為生物治療的建立提供原材料。然而在利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和原核注射技術(shù)建立轉(zhuǎn)基因嵌合體動物模型的過程中仍然存在效率較低的問題。因為在受精卵早期，胚胎中基因的表達和活性直到第一次有絲分裂開始才被激活。而NHEJ介導的基因修復能夠引入隨機長度DNA的插入突變，這種轉(zhuǎn)錄的延遲可能在CRISPR修飾的嵌合體小鼠生產(chǎn)過程中降低其效率[37, 38, 43]。

9 結(jié)論

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)為基因的編輯技術(shù)提供了一種可行的方案，同時這項技術(shù)也為研究基因的功能和基因缺陷性疾病提供了簡單有效的工具。而未來的研究對于提高CRISPR/Cas9的忠實性，降低其脫靶效率有重要的意義。而最新的基因組測序技術(shù)將有助于提高sgRNA的靶位點的特異性。

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（2019–09–30）

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