牛華星 陳玲 楊修鎮(zhèn) 劉少寧 尹伶靈 章安源

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)測(cè)定雞肝中慶大霉素殘留量

牛華星 陳玲 楊修鎮(zhèn) 劉少寧 尹伶靈 章安源

（山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所 山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 濟(jì)南 250022）

應(yīng)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)，建立了雞肝中慶大霉素c組分的檢測(cè)方法。樣品經(jīng)磷酸鹽緩沖液提取，陽(yáng)離子交換柱凈化，Poroshell HPH-C8(3.0×100mm，2.7μm)為分離色譜柱，以50mmol/L乙酸銨溶液(含2.0%氨水和0.2%甲酸)-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用電噴霧離子源正離子檢測(cè)模式(ESI+)和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式測(cè)定，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，慶大霉素在進(jìn)樣濃度在10~500ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2=0.9990)；方法檢出限和定量限分別為10μg/kg和25μg/kg；25、50、100、200μg/kg4個(gè)添加水平下，平均回收率在80%~100%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≤9.65%。本方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 雞肝 慶大霉素 組分

慶大霉素[1]是由小單孢菌產(chǎn)生的抗生素，至少由4種主要成分(C1、C1a、C2、C2a組分)和幾種微量成分組成(Claes等, 1984; Thomas和Tappin, 1974)屬氨基糖苷類抗生素藥(aminoglycosides，AGs)[2]。由于價(jià)格低廉，被廣泛使用于食品動(dòng)物，從而造成食品中的藥物殘留問題。為方便日常監(jiān)測(cè)，本文中采用液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法建立了雞肝中能同時(shí)測(cè)定慶大霉素4個(gè)組分的殘留分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設(shè)備 Waters Xevo TQ-S高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源)；CPA225D分析天平：感量0.01mg；PL602-S電子天平：感量0.01g；Milli-Q 超純水設(shè)備；水相針式濾器：孔徑0.22μm；Agilent PCX(60mg, 3ml)固相萃取柱。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品 慶大霉素(Gentamicin)：純度≥94%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司，其中C1組分含量為31.0%，C1a組分含量為22.2%，C2與C2a組分含量為46.8%。

1.1.3 試劑 乙腈、甲酸、甲醇、氨水、乙酸、乙酸胺為色譜純；三氯乙酸、乙二胺四乙酸、磷酸二氫鉀為優(yōu)級(jí)純。超純水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制 準(zhǔn)確稱取慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品配制成1000μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，4℃避光保存，有效期為3個(gè)月。吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用0.3%乙酸溶液稀釋定容，得到慶大霉素濃度為10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L和500μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，置4℃冰箱中避光保存。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 根據(jù)參考文獻(xiàn)[3]方法稱取試料2g±0.02g，于50ml離心管中，加10ml磷酸鹽緩沖液(稱取磷酸二氫鉀1.36g，用980ml水溶解，分別加入乙二胺四乙酸二鈉0.15g和三氯乙酸20g，溶解混勻并定容至1000ml，至4℃保存，有效期一個(gè)月)，渦漩混勻1min，超聲5min，以10000r/min離心10min。取上清液于另一50ml離心管中。殘?jiān)偌恿姿猁}緩沖液10ml，重復(fù)提取一次，合并兩次提取液并定容至20ml，渦旋混勻，為備用液。依次用甲醇5ml和水5ml活化PCX陽(yáng)離子交換柱，取10ml的備用液上柱，流干后，依次用水5m和甲醇5ml淋洗，抽干，用氨化甲醇5ml洗脫，收集洗脫液于10ml塑料離心管中，于40℃下用氮?dú)獯抵两桑?.3%醋酸水溶液溶解并定容至1ml，充分渦旋，用0.22μm濾膜過濾，上機(jī)待測(cè)。取空白樣品，同法處理，獲得試樣基質(zhì)空白溶液?？瞻自囼?yàn)除不加試料外，采用完全相同的測(cè)定步驟進(jìn)行平行操作。

1.2.2 液相色譜條件 色譜柱：Poroshell HPH-C8(3.0×100mm，2.7μm)；流動(dòng)相：A為50mmol/L乙酸銨溶液(含2.0%氨水和0.2%甲酸)，B為乙腈；流速：0.4ml/min，進(jìn)樣量：5μl。柱溫：35℃；梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.2.3 質(zhì)譜條件 根據(jù)參考文獻(xiàn)[4, 5]方法，電噴霧離子源，掃描方式：正離子掃描，檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。毛細(xì)管電壓：2.5KV，離子源溫度：150℃，脫溶劑氣溫度：500℃，錐孔氣流速：50L/h，脫溶劑氣流速：1000L/h，倍增器電壓：650V，二級(jí)碰撞氣：氬氣。定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、保留時(shí)間、錐孔電壓和碰撞能量參考值見表2。

表2 慶大霉素質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

注：帶*的離子對(duì)是定量離子對(duì)

1.2.4 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取相應(yīng)慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液用空白基質(zhì)溶液制得濃度為10、25、50、100、200、500ng/ml的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.5 準(zhǔn)確度和精密度 準(zhǔn)確稱取空白試料樣品雞肝臟2±0.02g，準(zhǔn)確加入適量標(biāo)準(zhǔn)工作液，使樣品中藥物的添加濃度為25μg/kg(定量限)、50μg/kg (1/2MRL)、100μg/kg(MRL)和200μg/kg(2MRL)，提取凈化處理后，經(jīng)高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，添加濃度各設(shè)置5個(gè)平行，重復(fù)3批。

1.2.6 測(cè)定方法 取試樣溶液和相應(yīng)的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，作單點(diǎn)校準(zhǔn)，外標(biāo)法計(jì)算?；|(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣溶液中各藥物的峰面積均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍內(nèi)。

表3 試樣溶液中離子相對(duì)豐度的允許偏差范圍 (%)

2 結(jié)果

2.1 線性考察

以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(表4)。慶大霉素藥物在濃度為10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L和500μg/L系列基質(zhì)添加濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析檢測(cè)，得到線性回歸方程見表4，在10~500 ng/ml的濃度范圍內(nèi)，該藥物的定量離子峰面積與濃度均呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.990。

表4 各可食性組織中慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和相關(guān)指數(shù)

表5 雞肝臟中慶大霉素的添加回收率、批內(nèi)和批間精密度 (ng/ml、%)

2.2 檢測(cè)限和定量限

雞肝中添加濃度為25μg/kg時(shí)，慶大霉素峰面積響應(yīng)值和信噪比滿足定量限的要求信噪比(S/N)≥10，因此確定方法的定量限為25μg/kg。添加濃度為10μg/kg時(shí)，慶大霉素峰面積響應(yīng)值和信噪比滿足定量限的要求信噪比(S/N)≥3，因此確定方法的檢測(cè)限為10μg/kg。

2.3 回收率及重復(fù)性試驗(yàn)

雞肝中添加慶大霉素，液質(zhì)分離良好，無(wú)干擾，添加濃度25μg/kg(定量限)、50μg/kg(1/2 MRL)、100μg/kg(MRL)和200μg/kg(2MRL)，添加濃度各設(shè)置5個(gè)平行，重復(fù)3批。批內(nèi)批間變異系數(shù)均小于10%，陽(yáng)性添加樣品的回收率在80%~ 100%(表5)批內(nèi)批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于9%。

3 討論與小結(jié)

（1）由于液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜存在基質(zhì)效應(yīng)，而且基質(zhì)中某些干擾組分的存在會(huì)使待測(cè)組分離子生成的速度與標(biāo)準(zhǔn)品相比有顯著不同，因此本試驗(yàn)對(duì)品基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行研究：用空白樣品制作空白基質(zhì)吹干后，加入一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液；在空白樣品中加入一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液；與相應(yīng)濃度的純標(biāo)準(zhǔn)溶液比較，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)明顯，因此定量時(shí)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）方法前處理簡(jiǎn)單，回收率和精密度能滿足分析要求，符合我國(guó)《獸藥殘留技術(shù)規(guī)范》[6]的要求，能快速準(zhǔn)確檢測(cè)雞肝中的慶大霉素殘留。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M]. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015. 1324-1326.

[2] 侯亞麗, 蘇亮, 丁平等. 慶大霉素的殘留檢測(cè)方法慶大霉素殘留[J]. 中國(guó)飼料, 2007(12): 28.

[3]田強(qiáng)兵, 巨歡等. 高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定魚肉中慶大霉素主要組分C1、C1a、C2[J]. 理化檢驗(yàn)(化學(xué)分冊(cè)). 2019, 55(1).

[4] 劉雪紅, 張秀琴, 侯穎等. 超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)牛奶中7種氨基糖苷類殘留[J]. 中國(guó)獸藥雜志, 2015, 49(3): 48-52.

[5]趙靜, 劉婷, 蔡柏巖等. HPLC法測(cè)定原料乳中慶大霉素殘留的研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2015, 36(9): 95-97.

[6]農(nóng)業(yè)部文件農(nóng)牧發(fā)[2003]1號(hào). 關(guān)于發(fā)布《獸藥殘留試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范(試行)》的通知[Z]. 2003.

（2019–08–05）

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1007-1733(2019)10-0011-03