禚寶山 李富金 李金波 秦緒偉 趙遠(yuǎn)

水貂眼炎雙球菌病的病原分離鑒定及治療

禚寶山 李富金 李金波 秦緒偉 趙遠(yuǎn)

（齊魯動(dòng)物保健品有限公司 山東 濟(jì)南 250100）

本研究對山東發(fā)病貂的眼炎進(jìn)行了病原篩選，棉拭子沾取眼結(jié)膜分泌物進(jìn)行了犬瘟熱、支原體PCR檢測，結(jié)果顯示：犬瘟熱陰性，支原體陽性；眼結(jié)膜棉式子細(xì)菌培養(yǎng)，不同場水貂均分離到相同細(xì)菌，經(jīng)純化培養(yǎng)、染色鏡檢、生化試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)和PCR檢測等試驗(yàn)，鑒定為雙球菌。對分離到的雙球菌及棉式子浸出過濾液進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)，結(jié)果顯示：單點(diǎn)雙球菌及支原體濾液與雙球菌混合液可復(fù)制出水貂眼炎，而單點(diǎn)支原體濾液不能復(fù)制水貂眼炎。分離菌對頭孢氨芐、復(fù)方阿莫西林、新霉素、丁胺卡那霉素高度敏感，敏感藥治療眼炎有效。

水貂眼炎 雙球菌病原 分離鑒定

雙球菌是鏈球菌科雙球菌屬的細(xì)菌，該菌廣泛分布于自然界中，常在于健康人、動(dòng)物的體表、黏膜上寄生，主要引起肺炎、支氣管炎、腦膜炎、尿道炎、中耳炎、敗血癥等疾病。資料顯示，雙球菌有廣泛的宿主，可以感染人與豬、羊、兔、水貂、狐貍、貉、犬、大熊貓等多種動(dòng)物。本菌感染動(dòng)物不同器官而引起不同病癥，其發(fā)病率、死亡率也因菌株本身致病性、感染動(dòng)物的易感性及感染器官不同而差異懸殊。目前，國內(nèi)對動(dòng)物雙球菌報(bào)道不多，且多集中在肺炎雙球菌，幾乎沒有眼炎雙球菌的報(bào)道。

近幾年，水貂秋季流淚濕眼圈臨床病例增多，以白貂多發(fā)，其他品種貂也有發(fā)生，輕重不一，有人懷疑是慢性犬瘟熱，有人懷疑是飼料、營養(yǎng)、環(huán)境等非傳染性因素引起，也有人認(rèn)為是其他致病菌引起，眾說紛紜，因很少引起死亡，且能自愈，因此關(guān)注的人不多，沒有文獻(xiàn)可查。2018年10月，筆者對山東臨沂、青島地區(qū)的兩個(gè)發(fā)生眼炎的水貂場進(jìn)行了臨床調(diào)查、病原分離鑒定、動(dòng)物回歸等實(shí)驗(yàn)室檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 將發(fā)病水貂保定后，用滅菌棉拭子沾取眼結(jié)膜、角膜的分泌物，每個(gè)場采集6只水貂分泌物棉式子。

1.1.2 培養(yǎng)基 血清營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基及SS培養(yǎng)基，均由齊魯動(dòng)物保健品有限公司生藥研究所(山東省獸用生物制品工程實(shí)驗(yàn)室)提供

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 健康青年水貂8只，購自章丘某水貂場。

1.1.4 藥敏片 氨芐青霉素、安普霉素、新霉素、丁胺卡那霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氟哌酸、林可霉素、大觀霉素、磷霉素購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.5 引物 犬瘟熱、細(xì)菌16S及支原體引物均由齊魯動(dòng)物保健品有限公司生藥研究所(山東省獸用生物制品工程實(shí)驗(yàn)室)提供。

1.1.6 儀器設(shè)備及其他實(shí)驗(yàn)用品 PCR儀A300型號，購自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP-9162型號，購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；顯微鏡CX-31，購自日本奧林巴斯；0.22um針頭濾器，購自Merck Millipore；染色液、離心管等實(shí)驗(yàn)室常用材料及設(shè)備均由齊魯動(dòng)物保健品有限公司生藥研究所(山東省獸用生物制品工程實(shí)驗(yàn)室)提供。

1.2 方法

1.2.1 現(xiàn)場調(diào)查 走訪臨沂沂南、青島膠南兩個(gè)水貂場，現(xiàn)場調(diào)查養(yǎng)殖環(huán)境、發(fā)病時(shí)間、臨床癥狀、發(fā)病率、病死率等。

1.2.2 細(xì)菌分離純化 把沾取了眼分泌液的棉式子，依次劃線接種血清瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基及SS培養(yǎng)基，37℃恒溫箱過夜。對分離到的細(xì)菌，挑取典型菌落，分區(qū)劃線接種血清瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行再次純化培養(yǎng)。

1.2.3 PCR檢測 將棉式子集中，加生理鹽水5ml，離心，取上清液，按照常規(guī)方法提取

1.2.4 染色鏡檢 挑取典型分離菌落涂片，革蘭氏染色，油鏡觀察。

1.2.5 生化試驗(yàn) 采取常規(guī)生理生化試驗(yàn)方法[1]，將純化后細(xì)菌接種到乳糖、麥芽糖、葡萄糖、菊糖、棉實(shí)糖及海藻糖等多種糖、甘露醇、梨醇、觸媒、膽鹽等微量發(fā)酵管中，置37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24~48h，觀察記錄結(jié)果。

1.2.6 溶血試驗(yàn) 將純化后的細(xì)菌，挑取典型菌落，劃線接種于綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基，置37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)18~24h，觀察記錄結(jié)果。

1.2.7 藥敏試驗(yàn) 采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法，將分離純化的細(xì)菌劃線在血清瓊脂培養(yǎng)基上，再將藥敏片貼在培養(yǎng)基上，置37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)18~24h，觀察記錄結(jié)果。

1.2.8 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 將8只健康青年水貂隨機(jī)分為4組，其中3組為試驗(yàn)組，另1組為對照。試驗(yàn)1組，水貂2只，用雙球菌培養(yǎng)液點(diǎn)眼；試驗(yàn)2組，水貂2只，用棉式子支原體液點(diǎn)眼；試驗(yàn)3組，水貂2只，用雙球菌與棉式子支原體濾液混合后點(diǎn)眼；對照組，用生理鹽水點(diǎn)眼。點(diǎn)眼后觀察試驗(yàn)貂眼睛是否有紅腫、流淚現(xiàn)象，連續(xù)觀察5d，如果復(fù)制出病癥，則觀察7d以上觀察炎癥發(fā)展情況。

2 結(jié)果

2.1 現(xiàn)場調(diào)查結(jié)果

臨沂的水貂場是一個(gè)擁有10000種貂的規(guī)模場，場內(nèi)設(shè)施設(shè)備齊全，場主從事水貂養(yǎng)殖多年，有豐富養(yǎng)殖經(jīng)驗(yàn)，第一次遇到這種病癥；青島的水貂場規(guī)模1000種貂，場主有30多年的養(yǎng)殖經(jīng)驗(yàn)，設(shè)施設(shè)備簡陋，但干凈衛(wèi)生，兩個(gè)場發(fā)病時(shí)間均在9月20號左右，并且周圍貂場也有不少出現(xiàn)這種病癥。臨床癥狀相似，表現(xiàn)為貂群中公貂突然有因流眼淚而濕眼圈的，傳播快，開始主要是流眼淚，有單眼流淚的，多數(shù)兩個(gè)眼都流淚，7~8d左右達(dá)到發(fā)病高峰，持續(xù)約20多天，發(fā)病率5%~30%，幾乎沒有死亡，極個(gè)別因感染其他疫病死亡，有人懷疑是非典型性犬瘟熱，做了犬瘟熱疫苗免疫，有人認(rèn)為濕眼圈病是季節(jié)病，不用治療，立冬后自愈。做犬瘟熱疫苗的效果不明顯，仍然有水貂陸續(xù)出現(xiàn)，沒有并發(fā)感染則很少有死亡。投喂抗生素能減輕癥狀。

2.2 細(xì)菌分離純化

兩個(gè)不同地區(qū)不同養(yǎng)殖場采集的棉式子，分離到相同的菌，分離菌在血清瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，形成細(xì)小、圓形、光滑、扁平菌落，麥康凱平板、SS瓊脂平板均不生長。

2.3 PCR擴(kuò)增

犬瘟熱陰性，雙球菌及支原體陽性。

2.4 染色鏡檢

視野中可見有革蘭氏陽性球菌，菌體呈現(xiàn)卵圓形，多數(shù)成雙排列，為雙球狀。

2.5 生化試驗(yàn)

分離菌可分解乳糖、麥芽糖、葡萄糖、菊糖、棉實(shí)糖及海藻糖，不分解甘露醇和梨醇，觸媒試驗(yàn)陰性，膽鹽溶解陽性。

圖1 PCR檢測電泳圖譜

(注：M：DL2000 Marker；1：CDV陽性對照；2：CDV陰性對照；3：樣品CDV樣品檢測；4：樣品雙球菌檢測；5：雙球菌陰性對照；6：支原體陽性對照；7：支原體陰性對照；8：樣品支原體檢測)

圖2 細(xì)菌鏡檢結(jié)果

2.6 溶血試驗(yàn)

在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，形成細(xì)小、透明菌落，有明顯的溶血環(huán)。

2.7 藥敏試驗(yàn)

分離菌對頭孢氨芐、復(fù)方阿莫西林、新霉素、丁胺卡那霉素高度敏感，環(huán)丙沙星、恩諾沙星中敏，慶大霉素、氟哌酸、林可霉素、大觀霉素、磷霉素不敏感。

2.8 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

試驗(yàn)1、3組水貂點(diǎn)眼后第2天均出現(xiàn)了羞明流淚臨床癥狀，試驗(yàn)2組及對照組水貂正常。

2.9 病貂治療

選擇敏感藥頭孢氨芐溶液點(diǎn)眼，3d后發(fā)病水貂眼炎恢復(fù)。

3 討論與小結(jié)

（1）引起水貂眼炎的因素很多，如維生素A缺乏、嚴(yán)重脂肪肝或者黃脂肪病等其他肝病發(fā)生，環(huán)境中有氨氣、刺激性消毒劑等化學(xué)物質(zhì)刺激均能引起非傳染性眼炎，若群中發(fā)病個(gè)體多，常誤以為是傳染病，條件改善，疫病很快消除，有別于傳染性因素，本文案例通過調(diào)查養(yǎng)殖場環(huán)境、飼養(yǎng)管理等，排除了非傳染因素。（2）眼睛感染支原體或綠膿桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、雙球菌等細(xì)菌會(huì)引起具有傳染性的眼炎，犬瘟熱等全身性疾患也有眼炎癥狀，為了篩查本案例的真正病原，實(shí)驗(yàn)室做了犬瘟熱、支原體PCR檢測，進(jìn)行了細(xì)菌分離，從結(jié)果上看，排除了犬瘟熱，分離到細(xì)菌，支原體PCR陽性，懷疑是可能與這兩種或者其中一種病原有關(guān)。（3）分離菌經(jīng)染色鏡檢，純化培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、PCR檢測，確定為致病性雙球菌。（4）動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果顯示，雙球菌是本案例的致病原，單純支原體并不能復(fù)制出臨床癥狀，排除了支原體單獨(dú)或者聯(lián)合致病的可能。（5）每年秋季，部分貂場的水貂出現(xiàn)流眼淚、濕眼圈及流眼眵等病癥，一段時(shí)間后該病癥可以自愈，因?yàn)楹苌僖鹚劳?，所以很少有人研究其病因，本研究從眼炎病例分離到雙球菌，并復(fù)制出病癥，確診為眼炎雙球菌，證實(shí)了雙球菌是秋季水貂濕眼圈病的病因之一。（6）該病很少引起死亡，但是有一定傳染性，環(huán)境中病菌一旦感染其他器官，可能會(huì)引起其他損失，不得不防。（7）通過藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分離菌株耐藥性并不強(qiáng)，敏感藥物比較多，氨芐青霉素溶液點(diǎn)眼，效果顯著，但應(yīng)該注意，直接點(diǎn)眼治療，選擇的藥物需要稀釋后不能傷害眼及眼結(jié)膜。

[1] 陸承平. 獸醫(yī)微生物學(xué)(第5版)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2013: 83-90.

[2] 莫玲, 王文秀, 劉吉山等. 兔肺炎雙球菌病的病原分離鑒定及治療[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2014, 35(11): 127-130.

[3] 秦緒偉, 禚寶山. 水貂肺炎雙球菌的分離與鑒定[J]. 山東畜牧獸醫(yī), 2014(6): 11-12.

[4] 王春花, 李德生, 王承東等. 大熊貓?jiān)捶窝纂p球菌的分離鑒定[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2012(1): 85-87.

[5] 秦緒偉, 青燕. 獺兔肺炎雙球菌的診斷與治療[J]. 中國養(yǎng)兔. 2017(4): 39-40.

[6] 張慶明. 一例水貂雙球菌病的診治[J]. 北方牧業(yè). 2016(19): 31.

[7] 秦緒偉. 一例狐貍肺炎雙球菌病診治[J]. 山東畜牧獸醫(yī). 2016(10): 35.

[8] 王春富. 一起貉肺炎雙球菌感染病例[J]. 北方牧業(yè). 2016(12): 31.

（2019–09–02）

S858.92

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1007-1733(2019)10-0003-03