張富友 宋艷 徐煜琳 鞠孜敬 崔治中 孫淑紅

禽沙門氏菌鑒別培養(yǎng)基和PCR檢測(cè)方法的建立

張富友 宋艷 徐煜琳 鞠孜敬 崔治中 孫淑紅*

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 山東 泰安 271018）

禽沙門氏菌是常見(jiàn)的一種人畜共患病原菌，快速準(zhǔn)確地檢測(cè)對(duì)于防控沙門氏菌病非常重要。傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測(cè)方法準(zhǔn)確，但操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本研究擬建立準(zhǔn)確快速的檢測(cè)技術(shù)。選擇疑似發(fā)生沙門氏菌病的某種雞群3個(gè)批次共計(jì)119份未出殼死胚樣品，分別經(jīng)BPW增菌，SC和TTB分別增菌后，再利用XLD鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)后，利用PCR方法進(jìn)行沙門氏菌的分離鑒定。同時(shí)，所有樣品均按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法(國(guó)標(biāo)法)進(jìn)行沙門氏菌的分離鑒定。結(jié)果顯示，本研究建立的沙門氏菌快速檢測(cè)方法與國(guó)標(biāo)法相比，沙門氏菌檢出率均為41.2%，吻合率100%；血清分型試驗(yàn)顯示，該49株沙門氏菌均為雞白痢沙門氏菌；本研究建立的檢測(cè)方法用時(shí)3d-6d，而國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法需要6d-9d。本研究表明，禽沙門氏菌鑒別培養(yǎng)基和PCR檢測(cè)技術(shù)可準(zhǔn)確、快速地完成沙門氏菌的檢測(cè)，而且成本更低。該技術(shù)方法可用于種雞群沙門菌感染狀態(tài)評(píng)估和調(diào)查分析以及規(guī)?；N禽場(chǎng)沙門菌凈化，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有重要的指導(dǎo)意義。

禽沙門氏菌 鑒別培養(yǎng) 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) PCR

禽沙門氏菌病是由不同血清型的沙門氏菌引起的禽類不同類型傳染病的總稱，根據(jù)病原體的抗原結(jié)構(gòu)不同可以分為雞白痢、禽傷寒和禽副傷寒[1]。禽沙門氏菌在世界各地普遍存在，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害很大[2]。同時(shí)，部分血清型的沙門氏菌是人畜共患病原菌，防控禽沙門氏菌病對(duì)公共衛(wèi)生有重要意義[3]。

目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法(國(guó)標(biāo)法)是用于禽沙門氏菌分離鑒定最常用的方法，該標(biāo)準(zhǔn)可保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，但是在疾病預(yù)防和疫情的應(yīng)急處理中不能夠適用。免疫學(xué)檢測(cè)方法相比傳統(tǒng)方法省時(shí)，靈敏度高，但大部分依賴設(shè)備，且對(duì)技術(shù)人員有一定的要求[4]。本研究擬簡(jiǎn)化傳統(tǒng)方法，把鑒別培養(yǎng)和PCR方法結(jié)合，既保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確和靈敏，又操作簡(jiǎn)單易行，建立適用于禽沙門氏菌快速鑒定的檢測(cè)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源 山東省某種雞群疑似發(fā)生沙門氏菌病，采集三個(gè)批次的未出殼死胚送檢，共計(jì)119份。

1.2 試劑 緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸鹽煌綠增菌液基礎(chǔ)(TTB)、碘液、0.1%煌綠、XLT4瓊脂、亞硫酸鉍瓊脂(BS)均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；2×Taq Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；沙門氏菌生化鑒定管(GB)購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；沙門菌屬診斷血清購(gòu)自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司。

1.3 增菌培養(yǎng) 按照GB 4789.4-2016規(guī)定進(jìn)行增菌培養(yǎng)。無(wú)菌取雞胚肝臟、部分腸段樣品，剪碎，加入BPW預(yù)增菌，37℃、220rpm/min培養(yǎng)8~ 18h；然后分別用SC培養(yǎng)基和TTB培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃、220rpm/min培養(yǎng)18~24h。

1.4 本研究建立的禽沙門氏菌鑒別培養(yǎng)基和PCR檢測(cè)方法

1.4.1 鑒別培養(yǎng) 取1.3增菌培養(yǎng)后樣品用三線法接種到XLD鑒別培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18~48h。

1.4.2 PCR鑒定 按照參考文獻(xiàn)[5]合成沙門氏菌通用引物FimW，由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成(引物見(jiàn)表1)，優(yōu)化其PCR反應(yīng)程序[6]。從XLD培養(yǎng)基上分別挑取4~6個(gè)可疑菌落，接種到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后用培養(yǎng)后的增菌液作為模板，進(jìn)行PCR方法檢測(cè)。

表1 FimW引物序列及片段大小

1.5 禽沙門氏菌檢測(cè)的國(guó)標(biāo)法 取1.3增菌培養(yǎng)后的樣品，按照GB 4789.4-2016規(guī)定進(jìn)行鑒別培養(yǎng)、生化試驗(yàn)等檢測(cè)。

1.6 沙門氏菌分離株的血清型鑒定 按照沙門菌屬診斷血清試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 禽沙門氏菌的鑒別培養(yǎng)基和PCR檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 疑似沙門氏菌的菌落形態(tài) SC和TTB選擇性增菌培養(yǎng)后，經(jīng)XLD鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，119樣品中有49樣品出現(xiàn)無(wú)色半透明菌落，疑似雞白痢沙門氏菌(圖1)。SC+XLD和TTB+XLD組合中可疑菌落比例分別為49/119和45/119。

圖1 疑似雞白痢沙門氏菌的菌落形態(tài)

2.1.2 PCR鑒定結(jié)果 用FimW引物進(jìn)行PCR鑒定結(jié)果表明，49株疑似沙門氏菌樣品均檢測(cè)為陽(yáng)性（圖2）。

圖2 部分樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2 禽沙門氏菌的國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 疑似沙門氏菌的菌落形態(tài) SC和TTB選擇性增菌培養(yǎng)后，經(jīng)XLD和BS鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，119樣品中，XLD培養(yǎng)基中出現(xiàn)無(wú)色半透明菌落，BS培養(yǎng)基上出現(xiàn)黑色或灰色有金屬光澤的菌落，SC+XLD、SC+BS、TTB+XLD和TTB+BS 4個(gè)組合中疑似雞白痢沙門氏菌感染的比例分別為49/119、11/119、45/119和15/119國(guó)標(biāo)法共分離到49株疑似沙門氏菌菌株。

2.2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果 從2.2.1中4個(gè)組合的XLD和BS培養(yǎng)基上分別挑取2個(gè)以上可疑菌落進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定，結(jié)果表明，大部分樣品三糖鐵瓊脂斜面呈紅色(產(chǎn)堿)，底層呈黃色(產(chǎn)酸)，部分樣品產(chǎn)氣，沒(méi)有樣品產(chǎn)H2S，大部分樣品賴氨酸呈紫紅色(陽(yáng)性)，少數(shù)呈黃色(陰性)，全部樣品蛋白胨水、尿素、氯化氫呈陰性，為A3反應(yīng)，需要補(bǔ)做ONPG。ONPG結(jié)果全部為陰性，表明該種雞群分離鑒定的49株可疑菌株全部為沙門氏菌。

2.3 禽沙門氏菌分離株的血清型鑒定結(jié)果

血清分型試驗(yàn)顯示，49株沙門氏菌O9；O12抗原凝集，為D群沙門氏菌；半固體培養(yǎng)基穿刺結(jié)果表明，全部菌株沒(méi)有生長(zhǎng)出鞭毛；結(jié)果表明，全部沙門氏菌為雞白痢沙門氏菌。

3 討論

3.1 兩種檢驗(yàn)方法的耗時(shí)比較

本研究建立的方法是通過(guò)前增菌、增菌、劃線培養(yǎng)、菌液PCR和血清學(xué)試驗(yàn)，耗時(shí)約3~6d，可一人獨(dú)立完成；國(guó)標(biāo)檢測(cè)通過(guò)前增菌、增菌、劃線培養(yǎng)、生化試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)，耗時(shí)約6~9d時(shí)間，但是生化試驗(yàn)需要兩人操作(一人獨(dú)立完成需增加1d)。生產(chǎn)中如果只針對(duì)沙門氏菌陽(yáng)性率檢驗(yàn)，可以省去血清學(xué)試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室方法大約使用3d左右的時(shí)間，國(guó)標(biāo)法則大約需要6d。綜上所述，本研究建立的方法更省時(shí)。

3.2 靈敏度、特異性的比較

實(shí)驗(yàn)室建立的方法共分到49株沙門菌，國(guó)標(biāo)法(GB 4789.4-2016)共分到49株沙門菌，二者沙門氏菌分離率一致，無(wú)差異。

3.3 資金費(fèi)用的比較

本研究建立的檢測(cè)技術(shù)更經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。僅用XLD培養(yǎng)基完成鑒別培養(yǎng)[6]，而國(guó)標(biāo)法中應(yīng)用XLD和BS兩種鑒別培養(yǎng)基；同時(shí)，用優(yōu)化的PCR方法代替了國(guó)標(biāo)法的耗時(shí)費(fèi)力且成本高的生化試驗(yàn)。

3.4 操作便捷的比較

前期試驗(yàn)證明，XLD培養(yǎng)基對(duì)禽沙門氏菌分離效果比BS培養(yǎng)基好，并且分離株包含BS培養(yǎng)基中分離到的菌株、XLD培養(yǎng)基可以取代BS培養(yǎng)基來(lái)實(shí)現(xiàn)禽沙門氏菌的分離鑒定。PCR方法更便捷，優(yōu)于生化試驗(yàn)。兩種方法中前增菌、增菌工作相同；PCR檢測(cè)需要用菌落或菌液做模板，PCR反應(yīng)完成后瓊脂糖凝膠電泳；而生化試驗(yàn)則需要準(zhǔn)備三糖鐵斜面、營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，操作過(guò)程中每個(gè)樣品需要依次經(jīng)過(guò)三糖鐵斜面劃線和穿刺、接種賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂，同時(shí)需要接種蛋白胨水、尿素瓊脂和氰化鉀培養(yǎng)基，然后根據(jù)初步判斷結(jié)果，判斷是否需要補(bǔ)做后續(xù)試驗(yàn)，該操作過(guò)程非常繁瑣，需要兩個(gè)人共同完成，中間容易出差錯(cuò)。

綜上所述，本研究建立的禽沙門氏菌鑒別培養(yǎng)基和PCR檢測(cè)方法優(yōu)于國(guó)標(biāo)法，具有準(zhǔn)確快速、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，可作為沙門菌感染狀態(tài)評(píng)估和調(diào)查分析以及規(guī)?；N禽場(chǎng)沙門菌凈化所需的檢測(cè)技術(shù)。

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（2019–09–29）

國(guó)家十三五重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2016YFD0501608）；山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目（SD2019XM009）

S852.61+2

A

1007-1733(2019)10-0001-03