梁成 陳智斌

Chen等[1]通過研究表明：CRSwNP組織中自噬表達下調，2015年齊君君等[2]發(fā)現(xiàn)鼻息肉組織的自噬相關基因及蛋白Beclinl-1表達下調、P62表達上調，CRSwNP組織中自噬水平降低。研究還發(fā)現(xiàn)，自噬水平的改變、缺陷以及功能障礙與呼吸道黏膜上皮損傷的形成、持續(xù)有著不可分割的聯(lián)系[3-5]。推測自噬參與鼻竇炎鼻息肉的形成，LC3Ⅱ和LAMP-2a分別作為大自噬和分子伴侶介導的自噬中最常見的標志物，通過觀察它們在鼻腔組織中的表達情況，有利于更深一步了解自噬與鼻竇炎鼻息肉的關系。

資料與方法

1 研究對象

選取本院CRSwNP患者鼻息肉組織以及鼻中隔偏曲患者下鼻甲組織（2016.08～2017.08），根據(jù)病理HE染色分成非嗜酸性粒細胞性鼻息肉組（mENP）10例（男8例，女 2例，年齡 33～66歲，平均 49.5歲），嗜酸性粒細胞性鼻息肉組（ENP）10例（男6例，女4例；年齡27～68歲，平均47.5歲），下鼻甲組（IT）10例(男 8例，女 2例；年齡 18～55歲，平均 36.5歲)。診斷標準參照中國慢性鼻竇炎診斷和治療指南（2018）[6]。排除條件：術前1個月內接受抗生素及糖皮質激素治療，或患有腫瘤、免疫缺陷及結核等嚴重全身疾病。該項目經本院倫理委員會同意，取得了充分的知情同意，并簽署相關知情同意書。

2 主要試劑及方法

2.1 HE染色法

首先清洗組織標本，在常溫條件下，用10%的中性緩沖福爾馬林固定標本24h，脫水，石蠟包埋，連續(xù)2μm切片，HE染色，觀察鼻息肉組織的整體細胞學構造。

2.2 免疫組化PV法

操作按照試劑盒 (福州邁新生物技術開發(fā)有限公司)說明書，將切片標本置于65℃烤箱烘烤2h，按序使用檸檬酸鈉抗原修復液高壓修復3min，過氧化氫阻斷內源酶，一抗LC3Ⅱ抗體（英國Biorbyt公司，orb97657）及LAMP-2a抗體（美國Abcam公司，ab18528）工作濃度均為 1∶500，4℃冰箱孵育過夜，二抗37℃孵育25min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色5min，蘇木素復染5～10s，脫水透明封片。

2.3 免疫組化的評分

4個低倍鏡(×200)視野中組織細胞呈棕黃色、棕褐色判定為陽性細胞，4個高倍鏡(×400)視野中計數(shù)陽性細胞比例，依次為：無以及極少量為(-)得0分；0%～25%為(+)得 1分；25%～50%為(++)得 2分；大于50%～75%為(+++)得 3分；大于75%為(++++)得 4分。

3 統(tǒng)計分析

使用軟件SPSS 20.0進行統(tǒng)計學分析。結果采用均數(shù)±標準差（±s）表示，首先使用 levene 檢驗方差的齊性和正態(tài)分布，用兩個獨立樣本t檢驗（t＜50），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 鼻息肉HE染色分型

鼻息肉由極度水腫的結締組織形成，間質中可見不同程度的炎性反應細胞浸潤，神經以及血管顯著減少。選取4個高倍鏡下視野并計算嗜酸性粒細胞（EOS）比例的平均值，高于10%則為ENP，低于10%則為 nENP[7]。見圖 1，圖 2。

圖1 大量EOS浸潤（400倍）

圖2 少量EOS浸潤（400倍）

2 免疫組化與統(tǒng)計學

2.1 標記蛋白定位

鼻息肉和下鼻甲黏膜中的LC3Ⅱ和LAMP-2a在細胞質和細胞膜中呈強陽性黃色表達，胞核也可以呈棕黃色染色。

2.2 蛋白質表達強度

LC3Ⅱ在IT組織中，上皮、腺體以及間質強表達（圖3），在ENP組織中主要以上皮強表達為主，間質以及腺體少量表達（圖4），在nENP組織中上皮、間質弱表達，腺體少量表達（圖5）；LAMP-2a在IT組織中上皮、腺體強表達，間質少量表達（圖6），在ENP組織中上皮、腺體、間質呈中等程度陽性表達（圖7），在nENP組織中上皮呈弱表達，間質、腺體少量表達（圖8）。

2.3 統(tǒng)計結果

見表 1～6。

圖3 LC3Ⅱ在IT中的表達（200倍）

圖4 LC3Ⅱ在ENP中的表達（200倍）

圖5 LC3Ⅱ在nENP中的表達（200倍）

圖6 LAMP-2a在IT中的表達（200倍）

圖7 LAMP-2a在ENP中的表達（200倍）

圖8 LAMP-2a在nENP中的表達（200倍）

表1 LC3Ⅱ免疫組織化學染色結果

表2 LC3Ⅱ在三組間兩兩比較

表3 LAMP-2a免疫組織化學染色結果

表4 LAMP-2a在三組間兩兩比較

表5 息肉組織中LC3Ⅱ和LAMP-2a的表達結果

表6 息肉組織中LC3Ⅱ和LAMP-2a檢驗及相關性

討論

對于鼻息肉的形成，目前認為主要與感染、變態(tài)反應、超抗原、生物膜、解剖異常以及基因表達異常等多重因素有關[8，9]。有限的研究表明，鼻息肉的自噬降低了[10]，而異常的自噬行為可導致鼻息肉的形成。自噬是一個高度保守的分解代謝過程，包括蛋白質聚集物、損傷的細胞器（線粒體、內質網等）以及各種病原體的自溶體降解，它代表一種適應性反應，以維持細胞和組織內的穩(wěn)態(tài)，應對眾多的細胞壓力。

自噬主要包括大自噬、小自噬和分子伴侶介導的自噬。LC3Ⅱ是監(jiān)測大自噬水平穩(wěn)定可靠的特異性標志物，其含量在一定程度上反映了自噬的數(shù)量，隨著自噬體膜的增加和LC3II表達的增加[11]，LC3II含量與自噬活性呈正相關，其含量可間接反映自噬水平[12]。正常情況下胞漿內的蛋白以及細胞器在胞漿中大致呈整體均勻分布，而本組實驗中在高倍鏡(×400)視野下觀察鼻息肉組織時，可見大量棕色點狀聚集形成于鼻息肉假復層纖毛上皮細胞胞漿以及胞核內，說明機體在受到損害時細胞自噬活動增加，細胞胞漿中LC3Ⅱ蛋白呈明顯的點狀或斑塊聚集，從形態(tài)學上表明自噬水平上調，但是又比正常下鼻甲組組織的表達強度明顯低，故鼻息肉組織的自噬水平較鼻甲組織是下降的，尤其在非嗜酸性粒細胞性鼻息肉組織中表現(xiàn)明顯。通過實驗數(shù)據(jù)分析：首先，LC3Ⅱ在IT組的表達水平高于鼻息肉（nENP+ENP）組，顯示了鼻腔組織從鼻甲黏膜到鼻息肉的形成過程中，大自噬水平是降低的或是不足，但兩者之間表達強度差異并沒有統(tǒng)計學意義；其次，三組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)IT組和nENP組的表達強度差異有統(tǒng)計學意義，而IT組和ENP組的表達強度差異卻沒有統(tǒng)計學意義，所以推測大自噬在鼻息肉組織中的下降僅僅出現(xiàn)在nENP組織中，ENP組織中大自噬的水平可能并不受影響，這不同于以往研究中關于鼻息肉中自噬水平下降這一相對籠統(tǒng)的觀點；進一步的分析nENP和ENP組織中LC3Ⅱ的表達差異發(fā)現(xiàn)，nENP的表達量顯著低于ENP，且兩者的差異有統(tǒng)計學意義，推測EOS的浸潤可能會上調鼻息肉組織中的大自噬水平，誘導炎癥反應，臨床上即表現(xiàn)為EOS的浸潤加重了鼻息肉組織的炎癥。事實上在很多炎癥、腫瘤的形成過程中，自噬都表現(xiàn)出降低的情況，但是，Yoshioka等揭示了在食道和胃腸惡性腫瘤中LC3II表達明顯高于癌旁組織。因此推測不同類型疾病形成LC3Ⅱ表達及作用各不相同。LAMP-2a是分子伴侶介導自噬（chaperonmediated autophagy,CMA）降解底物蛋白中含量最高的標志物，反映CMA的活性。一般情況下，CMA在輕度氧化應激作用下被激活時，LAMP-2a可表現(xiàn)出上調[13]，而本組實驗中在高倍鏡(×400)視野下觀察鼻息肉組織時，細胞胞漿中LAMP-2a蛋白呈明顯的點狀或斑塊聚集，從形態(tài)學上表現(xiàn)出和LC3Ⅱ相似的情況。本研究發(fā)現(xiàn)，由于僅IT組和nENP組的表達強度差異有統(tǒng)計學意義，IT組和NP組、IT組和ENP組、nENP和ENP的表達強度差異均沒有統(tǒng)計學意義，所以推測CMA在鼻息肉組織中的下降也僅僅出現(xiàn)在nENP組織中，但與EOS的浸潤可能會上調鼻息肉組織中的大自噬水平不同，EOS的浸潤并不影響鼻息肉組織中CMA的表達。

從本次實驗LC3Ⅱ與LAMP-2a的聯(lián)合檢測中能夠更完整推測：在炎癥、缺氧等條件刺激下，鼻息肉上皮細胞的自噬活動被激發(fā)增強，當這種激發(fā)增強的自噬不足以清除上皮細胞內的有害物質時，可能會誘發(fā)鼻息肉的逐步形成，從而表現(xiàn)出自噬活性的降低，在鼻息肉組織中LC3Ⅱ的表達水平（2.85±0.87）顯著高于 LAMP-2a（1.15±0.81），且它們之間的差異有統(tǒng)計學意義，顯示在鼻息肉組織的自噬路徑中，大自噬起到主導作用，CMA因其不具有特異性而表現(xiàn)出其從屬性。所以在不同的微環(huán)境條件下，它們可能被同時激活彼此間既有交融也有相對獨立的發(fā)揮空間。然而，迄今為止，大自噬和CMA參與鼻息肉形成的具體過程卻尚未見報道，但是可以確定的是自噬與許多慢性炎癥疾病有關。研究表明,自噬可以調節(jié)炎癥小體的活化，抑制炎性細胞因子IL-1β和IL-18的產生，誘導鼻黏膜上皮細胞自噬不足，通過激活凋亡通路,誘導上皮細胞凋亡，在病理情況下，凋亡細胞過多，特別是呼吸道上皮細胞缺失如鼻黏膜上皮細胞損傷和缺失，會引起上皮細胞屏障功能的損傷。同時也為細菌、病毒以及有害物質的入侵提供了便利條件和入口，引起黏膜下炎癥細胞及炎癥因子的聚集，它導致慢性鼻竇炎慢性黏膜下炎癥的持續(xù)存在。鼻息肉組織中缺乏自噬，導致鼻息肉組織來源的成纖維細胞COX-2產生促炎癥介質，組織結構重塑也導致慢性炎癥持續(xù)。嗜酸性粒細胞也可產生細胞因子、ECP、MBP等，加重其微環(huán)境結構特征的炎癥反應，后者可影響鼻腔上皮細胞的鈉離子通道，導致鈉離子吸收增加，組織水腫，鼻息肉的生長和增多，實驗顯示EOS的浸潤會導致息肉組織中的自噬水平提高，即表現(xiàn)為更重的炎癥反應，進一步證實了嗜酸性粒細胞鼻息肉有更加嚴重的臨床表現(xiàn)這一事實[14]。鼻息肉病以持續(xù)炎癥為特征，但發(fā)病機制復雜，尚存在爭議。自噬能否成為治療鼻息肉的手段目前完全是未知的。近些年來，針對調控自噬的靶向治療藥物成為了耳鼻喉科醫(yī)生研究的熱點，研究發(fā)現(xiàn)地塞米松誘導編碼應激反應蛋白Dig2、RTP801、REDDl的基因的表達[15]，而 Dig2、RTP801、REDDl(mTOR 信號通路的負調節(jié)物)的升高能夠誘導自噬。因此，地塞米松提高了自噬基因的表達[16]，減輕息肉炎癥反應，臨床試驗也證實皮質類固醇類藥物洗脫鼻竇植入物對ENP的治療表現(xiàn)出顯著的療效[17]。

綜上所述，nENP組織中自噬水平呈整體性下降，細胞內免疫防御機制失調，進而胞外激發(fā)免疫細胞特異性識別，導致鼻腔組織炎癥發(fā)生以及持續(xù)，而EOS的浸潤可能會提高鼻息肉組織中的大自噬水平，也即增強了鼻息肉組織的炎癥反應。