張 玲，石彩文，肖凱軍*，李春海，莫軍全，張 鐘，史煜宇

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510641；2.廣東石油化工學院生物與食品工程學院，廣東 茂名 525000）

羅非魚是世界水產(chǎn)業(yè)科研和養(yǎng)殖生產(chǎn)的重點淡水養(yǎng)殖魚類。近十年來，我國每年羅非魚產(chǎn)量以平均4.82%左右的速度遞增，穩(wěn)居世界首位[1]，但加工產(chǎn)品主要是品種單一、水平較低、附加值不高的凍魚片和凍全魚等[2]，生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的魚皮、魚鱗等副產(chǎn)物，約占魚體總質(zhì)量的40%～50%，除少部分被加工成魚粉作為飼料廉價出售，大多未得到充分利用，導致生物資源浪費，也帶來一系列環(huán)境問題[3]。隨著人們對生物分子結(jié)構(gòu)及功能的認識不斷深入以及國內(nèi)加工技術(shù)的不斷提高，利用魚皮、魚鱗提取明膠[4-6]及膠原蛋白多肽的研發(fā)[7-8]已成為熱點，也形成較大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)。

肽是由氨基酸組成的聚合物，主要來自于蛋白質(zhì)分解的中間產(chǎn)物。膠原蛋白肽是膠原或明膠經(jīng)酶解等處理后制得的具有較高消化吸收性、分子質(zhì)量為1 000～30 000 Da的產(chǎn)物，其不具有明膠的凝膠性能[9]，但具有多種人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能，如抗氧化[10]、抗菌[11-12]、降血壓[13]、抗疲勞[14]、抗腫瘤[15]等作用，在功能性食品[16-17]、醫(yī)學[18-19]、化妝品[20-21]等領域廣泛應用，因此測定多肽含量方法非常重要。

目前常見的多肽含量測定方法有雙縮脲法[22]、福林-酚試劑法[23]、鄰苯二甲醛法[24-25]、紫外吸收法等[26]，但同種方法測定不同類型、不同體系多肽含量的條件不同。雙縮脲比色法中最大吸收波長、肽的檢測濃度范圍、pH值、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）用量對檢測方法的適用性、準確度及重復性有顯著的影響且需要標準品，實際應用中多選用四肽（Gly-Gly-Tyr-Arg）標準品[27-28]，是非羅非魚源酶解蛋白肽的同源物，測定結(jié)果產(chǎn)生較大偏差，且價格昂貴。標準品或?qū)φ掌窇裱|(zhì)原則，可以消除方法基體效應引入的系統(tǒng)誤差[26]。羅非魚皮膠原蛋白肽與羅非魚源酶解多肽的成分相近，適宜用作肽含量檢測的對照品。

本研究選擇羅非魚皮膠原蛋白肽為對照品，對雙縮脲法測定多肽的方法進行改良，建立一套快速、相對準確的羅非魚源膠原蛋白肽酶解體系肽含量檢測方法，滿足羅非魚源膠原蛋白肽生產(chǎn)及產(chǎn)品品質(zhì)相關(guān)檢測的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標稱分子質(zhì)量為1、3 kDa和5 kDa的羅非魚皮膠原蛋白肽，標稱分子質(zhì)量為3 kDa和5 kDa的羅非魚鱗膠原蛋白肽（其分子質(zhì)量分布情況見文獻[29]）、羅非魚皮膠原蛋白（凍干品），均由廣東百維生物科技有限公司提供。

TCA、酒石酸鉀鈉、硫酸銅、氫氧化鈉等均為國產(chǎn)分析純。0.1 mol/L NaOH溶液、9～13 mol/L NaOH溶液、0.1 mol/L HCl溶液、6 mol/L HCl溶液用于調(diào)整檢測體系pH值。

雙縮脲試劑的配制：1.5 g硫酸銅和6.0 g酒石酸鉀鈉溶于500 mL蒸餾水中，攪拌加入300 mL的10% NaOH溶液，用蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 儀器與設備

722N可見分光光度計 上海同田生物技術(shù)有限公司；HR-120分析天平 四川中浪科技有限公司；CHYZ-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州博遠實驗分析儀器廠；PHS-25 pH計 上海雷磁儀器廠；80-2型離心機 金壇市大地自動化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 實驗流程

第1步：以羅非魚皮膠原蛋白肽（3 kDa）為標準曲線繪制的對照品，研究肽與雙縮脲顯色絡合物的最大吸收波長，尋找線性擬合良好的肽質(zhì)量濃度范圍，確定肽的理想檢測質(zhì)量濃度范圍，確定線性擬合度高的pH值及TCA質(zhì)量分數(shù)。

第2步：以羅非魚皮膠原蛋白肽（3 kDa）為標準曲線繪制的對照品，在第1步確定的理想條件下繪制標準曲線，并檢驗方法的精密度和重復性。

第3步：考慮實際檢測體系中可能有水解底物以及酶等蛋白質(zhì)的影響，為明確蛋白質(zhì)的干擾影響，以羅非魚膠原蛋白為檢驗蛋白質(zhì)，加入檢測體系中，檢測本法的加樣回收率和偏差。

第4步：考慮實際生產(chǎn)中有不同分子質(zhì)量的羅非魚皮和魚鱗肽產(chǎn)品，檢測體系中肽的種類與標準曲線對照品（標稱分子質(zhì)量為3 kDa的羅非魚皮膠原蛋白肽）有差別，為檢驗本法在不同肽產(chǎn)品檢測中的適用性，將標準曲線應用于標稱分子質(zhì)量為1 kDa和5 kDa的羅非魚皮膠原蛋白肽和標稱分子質(zhì)量為3 kDa和5 kDa的羅非魚鱗膠原蛋白肽的檢測中，通過回收率及偏差檢驗本法的適用性。

1.3.2 測定方法最適參數(shù)的選定

1.3.2.1 絡合物最大吸收波長的確定

分別取質(zhì)量濃度為6 mg/mL的3 kDa羅非魚皮膠原蛋白肽溶液0、0.2、0.5、4.0、8.0 mL于一組50 mL燒杯中，用14% TCA溶液補足至12 mL，立即加入8 mL雙縮脲試劑，分別調(diào)整pH 13.5（控制體積偏差不大于2.5%），立即在波長470～630 nm范圍內(nèi)進行波段掃描確定最大吸收波長。

1.3.2.2 線性擬合良好的肽質(zhì)量濃度范圍的確定

分別取質(zhì)量濃度為6 mg/mL的3 kDa羅非魚皮膠原蛋白肽溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 mL于一組50 mL的燒杯中，用14% TCA溶液補足至12 mL，立即加入8 mL雙縮脲試劑，分別調(diào)整pH 12.5、13.0、13.5（控制體積偏差≤2.5%），立即于1.3.2.1節(jié)中確定的最大吸收波長處測定吸光度。以肽質(zhì)量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線并按照肽質(zhì)量濃度分段進行線性回歸，以R2值大小判斷線性擬合程度，確定溶液中多肽的最佳檢測質(zhì)量濃度范圍。

1.3.2.3 最適pH值的確定

以1.3.2.2節(jié)實驗結(jié)果為依據(jù)，分別取質(zhì)量濃度為6 mg/mL的3 kDa羅非魚皮膠原蛋白肽溶液0、1.0、3.0、5.0 mL于一組50 mL的燒杯中，用14% TCA溶液補足至12 mL，立即加入8 mL雙縮脲試劑，調(diào)整pH 10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5（控制體積偏差不大于2.5%），立即于最大吸收波長處測定吸光度，找出pH值變化不影響吸光度大小的區(qū)域，即為檢測最適的pH值范圍。

1.3.2.4 TCA溶液最適質(zhì)量分數(shù)確定

分別取7%的羅非魚皮膠原蛋白溶液（膠原蛋白需先置于50～60 ℃水浴鍋中加熱溶解）1.0 mL于20 mL的離心管中，分別立即加入10 mL質(zhì)量分數(shù)5%、8%、10%、11%、12%、13%、14%、17% TCA溶液，靜置10 min后，3 500 r/min離心15 min。分別取上清液1.0、2.0 mL和4.0 mL于一組50 mL燒杯中，對應加入質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL的3 kDa羅非魚皮膠原蛋白肽溶液1.0、2.0 mL和2.0 mL，每個體積比一組共8 份，用對應質(zhì)量分數(shù)的TCA溶液補足至12 mL，立即加入8 mL雙縮脲試劑，調(diào)整到最適pH值（控制體積偏差不大于2.5%），在最大吸收波長處測定吸光度，找出TCA溶液質(zhì)量分數(shù)變化不影響吸光度大小的區(qū)域，即為TCA溶液最適質(zhì)量分數(shù)范圍。

1.3.3 最適條件下標準曲線的制作

以1.3.2節(jié)實驗結(jié)果為依據(jù)，分別取質(zhì)量濃度為6 mg/mL的3 kDa羅非魚皮膠原蛋白肽溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于一組50 mL的燒杯中，用1.3.2.4節(jié)方法確定的TCA溶液最適質(zhì)量分數(shù)補足至12 mL，立即加入8 mL雙縮脲試劑，按1.3.2.3節(jié)方法確定的最適pH值調(diào)整（控制體積偏差不大于2.5%），立即于最大吸收波長處測定吸光度。以多肽質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制最適條件下標準曲線并進行線性回歸，以R2值大小判斷線性擬合程度。

1.3.4 精密度實驗

分別取質(zhì)量濃度為9 mg/mL的3 kDa羅非魚皮膠原蛋白肽溶液2 mL于一組50 mL燒杯中，按1.3.3節(jié)方法測定吸光度，再計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），檢驗該方法的精密度。

1.3.5 重復性實驗

分別取質(zhì)量濃度為9 mg/mL的3 kDa羅非魚皮膠原蛋白肽溶液2 mL于一組50 mL燒杯中，按1.3.3節(jié)方法測定吸光度，根據(jù)線性回歸方程計算多肽含量，再計算RSD，檢驗該方法的重復性。

1.3.6 魚皮膠原蛋白肽的加樣回收率

分別取質(zhì)量濃度為9 mg/mL的3 kDa羅非魚皮膠原蛋白肽溶液0、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5 mL于一組50 mL的燒杯中，按1.3.3節(jié)方法測定吸光度，根據(jù)線性回歸方程計算多肽含量、回收率及RSD。

1.3.7 羅非魚皮膠原蛋白肽與魚皮膠原蛋白的加樣回收率

分別取7%的羅非魚皮膠原蛋白溶液（膠原蛋白需先置于50～60 ℃水浴鍋中加熱溶解）1.0 mL于20 mL的離心管中，立即加入10 mL 1.3.2.4節(jié)確定的最適質(zhì)量分數(shù)的TCA溶液，靜置10 min后，3 500 r/min離心15 min。分別取上清液2.0 mL于一組50 mL燒杯中，再分別加入質(zhì)量濃度為9 mg/mL的3 kDa羅非魚皮膠原蛋白肽溶液0、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5 mL于燒杯中，按1.3.3節(jié)方法測定吸光度，根據(jù)線性回歸方程計算多肽含量、回收率及RSD。

1.3.8 羅非魚膠原蛋白肽加樣回收率

用標稱分子質(zhì)量為1 kDa和5 kDa的羅非魚皮膠原蛋白肽和標稱分子質(zhì)量為3 kDa和5 kDa的羅非魚鱗膠原蛋白肽，按照1.3.6節(jié)方法進行加樣回收率實驗。

1.3.9 羅非魚膠原蛋白肽與羅非魚皮膠原蛋白的加樣回收率

用標稱分子質(zhì)量為1 kDa和5 kDa的羅非魚皮膠原蛋白肽和標稱分子質(zhì)量為3、5 kDa的羅非魚鱗膠原蛋白肽，按照1.3.7節(jié)進行加明膠加樣回收率實驗。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實驗均重復3 次，取平均值；采用SPSS Statistices 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析；采用Origin 8.5軟件進行圖片繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 絡合物最大吸收波長的確定

圖1 雙縮脲絡合物波段掃描曲線Fig. 1 Absorption spectra of biuret complex at different concentrations

從圖1可以看出，不同質(zhì)量濃度的魚皮膠原蛋白肽在470～630 nm的最大吸收波長均為545 nm，這與文獻[22]報道的多肽與雙縮脲絡合物最大吸收波長一致，因此本實驗確定545 nm為檢測最適波長。

2.2 多肽線性質(zhì)量濃度范圍的確定

圖2 多肽線性擬合曲線Fig. 2 Linear fi tting curves of peptide

表1 多肽質(zhì)量濃度與吸光度線性關(guān)系擬合方程Table1 Linear fi tting curves between polypeptide concentration and absorbance

如圖2、表1所示，多肽質(zhì)量濃度在0.03～0.15 mg/mL與1.8～3.0 mg/mL范圍內(nèi)，不同pH值的線性回歸曲線R2均低于0.99，擬合程度相對較低。而在質(zhì)量濃度為0.3～1.5 mg/mL范圍內(nèi)，不同pH值的曲線都呈線性分布，且R2大于0.99，相關(guān)性較好。因此可以確定多肽溶液最佳檢測質(zhì)量濃度范圍為0.3～1.5 mg/mL。

2.3 最適pH值的確定

圖3 最適pH值曲線Fig. 3 Determination of optimal pH

由圖3可知，在pH 10.5～12.0范圍內(nèi)魚皮膠原蛋白多肽溶液的吸光度隨著pH值的增大而不斷增大，而在pH 12.5～13.5內(nèi)呈現(xiàn)出吸光度大小不受pH值變化的影響，即pH 12.5～13.5為檢測最適pH值范圍，在此范圍內(nèi)多肽含量的檢測不受pH值影響，因而從經(jīng)濟效益及操作安全方面考慮，選擇最適pH值為12.5。

2.4 最適TCA溶液質(zhì)量分數(shù)的確定

圖4 最適TCA溶液質(zhì)量分數(shù)曲線Fig. 4 Determination of optimum TCA concentration

由圖4可知，在TCA溶液質(zhì)量分數(shù)為5%～10%范圍內(nèi)吸光度很大且曲線平緩，是因為使用的TCA溶液質(zhì)量分數(shù)不足以沉淀膠原蛋白，TCA溶液質(zhì)量分數(shù)微弱的變化就能很明顯地展現(xiàn)在曲線上，因此在TCA溶液質(zhì)量分數(shù)為5%～10%的曲線相對陡峭；TCA溶液質(zhì)量分數(shù)為10%～12%范圍內(nèi)曲線下降趨勢逐漸趨于平緩；而TCA溶液質(zhì)量分數(shù)在14%～17%時吸光度也有較明顯的下降，這可能是因為TCA過量造成體系pH值過低，促使部分多肽水解成氨基酸。3 條曲線在TCA溶液質(zhì)量分數(shù)13%～14%的范圍內(nèi)吸光度大小均表現(xiàn)出不受TCA溶液質(zhì)量分數(shù)變化的影響。研究TCA用量對不同比例膠原蛋白和肽體系中檢測吸光度的影響，目的是找出TCA用量不影響肽含量檢測的范圍，從實驗結(jié)果可知，TCA溶液質(zhì)量分數(shù)為13%～14%滿足要求，再結(jié)合成本考慮，可選擇最適TCA溶液質(zhì)量分數(shù)為13%。

2.5 最適條件下標準曲線的繪制

基于單因素試驗結(jié)果，選擇標稱分子質(zhì)量為3 kDa的羅非魚皮膠原蛋白肽為對照品，在質(zhì)量濃度0.3～1.5 mg/mL范圍內(nèi)，用蒸餾水配制質(zhì)量濃度為0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mg/mL的肽溶液，添加13% TCA溶液，調(diào)整體系pH 12.5（控制體積偏差不大于2.5%），在波長545 nm處測定吸光度，繪制標準曲線。

擬合方程為y=0.144 9x＋0.001 5，R2為0.999，表明該方法中吸光度與樣品質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好，可應用于雙縮脲法測定多肽含量，線性質(zhì)量濃度范圍為0.3～1.5 mg/mL。

2.6 精密度實驗結(jié)果

表2 魚皮膠原蛋白肽（3 kDa）精密度實驗結(jié)果Table 2 Precision for fi sh skin collagen peptide (3 kDa)

取質(zhì)量濃度為9 mg/mL的3 kDa羅非魚皮膠原蛋白肽溶液2 mL共6 份，按照最佳條件加入檢測試劑（最終肽溶液被稀釋成20 mL，質(zhì)量濃度為0.9 mg/mL），并測定吸光度。由表2可知，RSD為1.84%，說明本測定方法的精密度較好。

2.7 重復性實驗結(jié)果

表3 魚皮膠原蛋白肽（3 kDa）重復性實驗結(jié)果Table 3 Repeatability for fi sh skin collagen peptide (3 kDa)

取質(zhì)量濃度為9 mg/mL的3 kDa羅非魚皮膠原蛋白肽溶液2 mL共6 份，按照最佳條件加入檢測試劑，并測定吸光度，再根據(jù)線性回歸方程計算多肽的含量，再計算RSD，檢驗該方法的重復性。由表3可知，測定含量平均值為107.7%，RSD為1.86%，說明本測定方法的重復性良好。

2.8 魚皮膠原蛋白肽的加樣回收率

表4 魚皮膠原蛋白肽（3 kDa）加樣回收率Table 4 Recoveries for fi sh skin collagen peptide (3 kDa)

用質(zhì)量濃度為9 mg/mL的3 kDa羅非魚皮膠原蛋白肽溶液，在最佳檢測條件下配制成不同質(zhì)量濃度的檢測體系，檢測吸光度，計算肽的實測質(zhì)量濃度，并計算平均回收率。由表4可知，平均回收率為109.7%，RSD為1.00%。

2.9 魚皮膠原蛋白肽與膠原蛋白的加樣回收率

表5 魚皮膠原蛋白肽（3 kDa）與魚皮膠原蛋白的加樣回收率Table 5 Recoveries for fi sh skin collagen peptide (3 kDa) with the addition of fi sh skin collagen

在檢測體系中引入質(zhì)量分數(shù)為7%的羅非魚皮膠原蛋白溶液，在固定條件下肽的實測質(zhì)量濃度，與樣品真實質(zhì)量濃度進行比較并計算加樣回收率。由表5可知，平均回收率為113.9%，RSD為1.39%。與2.8節(jié)的回收率和RSD結(jié)果接近，說明此工藝條件測定多肽含量不會導致膠原蛋白水解，此法測定多肽含量的結(jié)果準確、可靠。

2.10 羅非魚膠原蛋白肽及魚皮膠原蛋白的加樣回收率

表6 魚皮膠原蛋白肽（5 kDa）加樣回收率Table 6 Recoveries for fi sh skin collagen peptide (5 kDa)

表7 魚皮膠原蛋白肽（5 kDa）與魚皮膠原蛋白的加樣回收率Table 7 Recoveries for fi sh skin collagen peptide (5 kDa) with the addition of fi sh skin collagen

表8 魚皮膠原蛋白肽（1 kDa）加樣回收率Table 8 Recoveries for fi sh skin collagen peptide (1 kDa)

表9 魚皮膠原蛋白肽（1 kDa）與魚皮膠原蛋白的加樣回收率Table 9 Recoveries for fi sh skin collagen peptide (1 kDa) with the addition of fi sh skin collagen

表10 魚鱗膠原蛋白肽（5 kDa）加樣回收率Table 10 Recoveries for fi sh scale collagen peptide (5 kDa)

表11 魚鱗膠原蛋白肽（5 kDa）與魚皮膠原蛋白的加樣回收率Table 11 Recoveries for fi sh scale collagen peptide (5 kDa) with the addition of fi sh skin collagen

表12 魚鱗膠原蛋白肽（3 kDa）加樣回收率Table 12 Recoveries for fi sh scale collagen peptide (3 kDa)

表13 魚鱗膠原蛋白肽（3 kDa）與魚皮膠原蛋白的加樣回收率Table 13 Recoveries for fi sh scale collagen peptide (3 kDa) with the addition of fi sh skin collagen

從表6～13可以看出，改變檢測體系中的羅非魚肽的種類后，加樣回收率相差不大，偏差均較小，說明本法適用于羅非魚源肽含量的檢測。

3 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，雙縮脲比色法檢測魚皮膠原蛋白肽的最佳工藝條件為波長545 nm、體系pH 12.5、1 3% T C A溶液，肽測定的線性質(zhì)量濃度范圍為0.3～1.5 mg/mL，得到重復性和精密度實驗的RSD分別為1.86%、1.84%，加入膠原蛋白與未加入膠原蛋白的平均回收率分別為113.9%、109.7%，RSD分別為1.39%、1.00%，相差不大；將本法應用于不同種類羅非魚肽產(chǎn)品體系的檢測，加樣回收率相差不大，偏差都較小，說明本法適用于羅非魚源肽含量的檢測。

雙縮脲法既能測定蛋白質(zhì)含量也能測定肽含量，其機理主要是雙縮脲試劑與蛋白質(zhì)和肽結(jié)構(gòu)中—CONH—基團在堿性環(huán)境中發(fā)生雙縮脲反應生成顯色絡合物。本法采用TCA去除體系中存在的酶解底物及酶等蛋白質(zhì)對肽含量檢測的干擾，但加入TCA可能會導致蛋白質(zhì)的水解，造成檢測結(jié)果偏高。本研究發(fā)現(xiàn)體系pH值對絡合物顯色情況有重要影響，當pH值在3.5～4.5之間時，體系由無色轉(zhuǎn)變成淺藍色；在pH 8～9之間才會由淺藍色變成紫色；在pH 10.0～12.5之間，pH值越高，體系吸光度越大，pH值會影響測定結(jié)果；在pH 12.5～13.5之間，pH值不再影響吸光度的測定。調(diào)整體系pH值一定要精確、迅速并控制調(diào)整后的總體積偏差。體系中多肽含量范圍對線性關(guān)系也很重要，為提高檢測準確度，一定要控制體系多肽質(zhì)量濃度在0.3～1.5 mg/mL范圍內(nèi)。此外，樣品檢測體系調(diào)整好后應立即測定吸光度，必須在1 min內(nèi)完成檢測，否則體系會產(chǎn)生肉眼能見的色差，造成檢測誤差。

本研究遵循同質(zhì)原則，選用羅非魚皮膠原蛋白肽作為對照品，對經(jīng)典的雙縮脲法測定多肽含量中幾個關(guān)鍵影響因素進行了細化研究，找到了理想條件，建立了一套較為精確的檢測方法，適應于羅非魚源膠原蛋白肽含量的快速檢測，具有良好的實際應用前景；但對于其他魚類膠原蛋白肽含量的檢測是否適用，則需進一步研究。