張宏蕊，張九凱，韓建勛，邢冉冉，鄭 磊，陳 穎,*

（1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

瑪咖（Lepidium meyenii Walp.）是十字花科獨行菜屬1 a生或2 a生的草本植物，原產(chǎn)地位于海拔3 700～4 500 m的秘魯安第斯山脈[1]?，斂Ц侵饕氖秤貌课?，在南美藥食兼用的歷史已有數(shù)千年之久，享有“南美人參”的稱號[2-4]。瑪咖中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、膳食纖維、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)[5-8]，此外，研究發(fā)現(xiàn)瑪咖還含有瑪咖酰胺、瑪咖烯[9]、芥子油苷[10]、生物堿[11]和甾醇[12]等次級代謝產(chǎn)物。國外對瑪咖的研究較早，主要集中在瑪咖的成分分析、藥理功效、保健作用及機(jī)理等方面，較多研究證明瑪咖能夠提高生育力、改善性功能[13]、緩解疲勞[14]、抗氧化[6]、保護(hù)神經(jīng)[15]、減緩更年期綜合征[16]和預(yù)防骨質(zhì)疏松[17]等。

1982年，聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織通過國際會議呼吁瑪咖的營養(yǎng)價值和保健作用，多次向各國推薦種植[18-19]。2011年原中國衛(wèi)生部發(fā)布公告批準(zhǔn)瑪咖粉為新資源食品[20]。2002年瑪咖在我國云南引種成功，隨后在四川、新疆、西藏、貴州和青海等地進(jìn)行廣泛引種，瑪咖種植得到迅速發(fā)展，其中，種植面積最大的基地主要位于云南麗江、迪慶和會澤等地[21-22]。但瑪咖的生長條件較為苛刻，只適合在高海拔高寒地區(qū)、晝夜溫差大和雨水充沛的環(huán)境中生長，所以不同產(chǎn)地瑪咖的品質(zhì)相差甚大[23]。秘魯瑪咖歷史悠久，被視為“秘魯國寶”，所以不法商家為了謀取更多利益，通常利用國內(nèi)云南和新疆等地瑪咖冒充秘魯瑪咖進(jìn)行銷售；而云南產(chǎn)地的地理條件更接近秘魯瑪咖生長條件，瑪咖大而飽滿，售價高于其他產(chǎn)地，尤其是麗江瑪咖品質(zhì)出眾，售價相對較高，因而常以新疆、西藏和四川等地瑪咖冒充云南麗江瑪咖出售[24]。因此很多學(xué)者開展對瑪咖的產(chǎn)地鑒別研究。目前瑪咖產(chǎn)地鑒別的主要研究方法包括紅外光譜、近紅外光譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和電噴霧質(zhì)譜等。王元忠等[25-26]分別通過紅外光譜和近紅外光譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對云南及秘魯瑪咖進(jìn)行了產(chǎn)地區(qū)分；劉宇等[27]采用紅外光譜結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）有效地區(qū)分了瑪咖產(chǎn)地；楊春艷等[28]根據(jù)傅里葉變換紅外光譜結(jié)合馬氏距離判別分析方法鑒別瑪咖產(chǎn)地，正確率達(dá)92.7%；另外Pan Yu等[29]利用液相色譜紫外檢測串聯(lián)質(zhì)譜研究了不同產(chǎn)地的瑪咖的瑪咖酰胺含量差異，并根據(jù)正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）模型區(qū)分產(chǎn)地；孫佳明等[30]應(yīng)用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法檢測了瑪咖的低極性組分，通過灰色關(guān)聯(lián)度分析和偏最小二乘法分析得到最佳促睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖活性成分的是N-芐基-十六酰胺，另外結(jié)合多種化學(xué)計量學(xué)方法區(qū)分了云南和秘魯瑪咖。

代謝組學(xué)具有整體分析的能力，能夠反映外源性物質(zhì)對生物體產(chǎn)生的整體性效應(yīng)。代謝組學(xué)所研究的代謝物位于生理、生化活動調(diào)控的末端，更能夠反映生物體變化規(guī)律的整體性?；诖x組學(xué)技術(shù)的瑪咖產(chǎn)地鑒別，更能全面、準(zhǔn)確地進(jìn)行產(chǎn)地的區(qū)分并能發(fā)現(xiàn)代謝物在各產(chǎn)地的分布差異。本研究通過基于代謝組學(xué)技術(shù)的液相色譜-質(zhì)譜方法對不同產(chǎn)地的瑪咖進(jìn)行全掃描分析，根據(jù)靶標(biāo)和非靶標(biāo)代謝組學(xué)方法篩查鑒定瑪咖代謝物，分析各產(chǎn)地代謝物差異，旨在為瑪咖的產(chǎn)地鑒別和質(zhì)量評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

共收集瑪咖干根樣品13 種，分別來自于秘魯、云南、西藏、四川和新疆5 個產(chǎn)地，采集于2017年11—12月，生產(chǎn)年限均為1 a。所有樣品由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所李晚宜研究員進(jìn)行形態(tài)鑒定，并在實驗室內(nèi)采用實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法進(jìn)行物種確證。樣品編號及產(chǎn)地信息見表1。

表1 實驗樣品信息Table 1 Information about Maca samples

甲醇、甲酸、乙酸銨和乙腈（均為色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TripleTOF 5600超高壓液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源和大氣壓化學(xué)電離源）美國AB SCIEX公司；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；TissueLyser II型組織研磨儀 上海凱杰企業(yè)管理有限公司；Bencbtopk冷凍干燥機(jī) 美國VirTis公司；Biofuge Stratos離心機(jī) 德國賀利氏有限公司；R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

瑪咖干根置于液氮中至少浸泡1 min，用研缽搗碎，于料理機(jī)中打成粗粉，放入真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48 h。用組織研磨機(jī)研磨成細(xì)膩的粉末，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，放入-40 ℃冰箱貯存。稱取0.2 g樣品加入3 mL甲醇于離心管中，30 ℃超聲水浴1 h，8 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移到5 mL離心管中，殘余物用2 mL甲醇再萃取1 次。合并上清液旋轉(zhuǎn)蒸干，每種溶劑定容到2 mL，12 000 r/min離心10 min，過濾膜，稀釋4 倍備用。參考Qiu Shi等[31]代謝物提取方法，提取溶劑選擇甲醇、乙醇、乙酸乙酯3 種溶劑提取瑪咖代謝物，甲醇提取的瑪咖代謝物離子響應(yīng)強(qiáng)度最大，因此最終的提取溶劑確定為甲醇。

1.3.2 色譜條件

Phenomenex Kinetex?C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動相A為3 mmol/L乙酸銨溶液含0.02%甲酸，流動相B為3 mmol/L乙酸銨-乙腈溶液含0.02%甲酸；進(jìn)樣量2 μL；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；洗脫梯度：0～3 min，10% B；3～14 min，10%～40% B；14～17 min，40%～100% B；17～17.1 min，100% B；17.1～20 min，10% B。整個洗脫過程時間為20 min。在正離子模式下向流動相中加入乙酸銨能夠誘導(dǎo)[M＋NH4]＋離子的產(chǎn)生，加入甲酸有助于洗脫離子的質(zhì)子化，使得較弱強(qiáng)度的[M＋H]＋離子更容易被檢測到。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正離子掃描方式；離子源溫度500 ℃；正離子噴霧電壓5 500 V；去簇電壓80 V。質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過信息依賴檢索方法進(jìn)行動態(tài)背景扣除。霧化氣壓力50 psi，輔助加熱氣壓力50 psi，氣簾氣壓力35 psi。離子碰撞能量40 eV，質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 000。每個循環(huán)內(nèi)包括1 個一級質(zhì)譜掃描（250 ms）和10 個二級質(zhì)譜掃描（每個50 ms）。

1.3.4 數(shù)據(jù)預(yù)處理和化學(xué)計量學(xué)分析

采用MarkerView 1.2.1軟件對Q-TOF獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，包括數(shù)據(jù)的挖掘、校準(zhǔn)和歸一化等。具體參數(shù)設(shè)置如下：數(shù)據(jù)挖掘的范圍m/z100～1 000，保留時間0.5～18 min；峰檢測：最小光譜寬度為2.5×10-5，最小色譜峰寬為6，噪聲閾值為100；峰校準(zhǔn)和篩選：質(zhì)量數(shù)偏差為1×10-5，保留時間偏差為0.5 min[32]。最大出峰數(shù)設(shè)為8 000。數(shù)據(jù)預(yù)處理后將峰度信息導(dǎo)出到SIMCA 14.0軟件中進(jìn)行PCA和OPLS-DA。另外，利用MeV4.9軟件進(jìn)行各產(chǎn)地瑪咖代謝物的熱圖分析。

1.3.5 非靶標(biāo)代謝物鑒定

將檢測到的所有峰的信息導(dǎo)入到SIMCA軟件，進(jìn)行PCA和OPLS-DA后，得到載荷圖。根據(jù)載荷圖，變異權(quán)重參數(shù)值（variable importance in projection，VIP）大于1以及P值小于0.05篩選出標(biāo)志離子。將標(biāo)志離子的信息導(dǎo)入PeakView軟件，利用Formula Finder進(jìn)行分子式的確定，理論和實際的理論偏差小于5×10-6，同位素的分布在理論分布范圍的20%以內(nèi)。標(biāo)志物在HMDB、Metlin等數(shù)據(jù)庫搜索后得到二級質(zhì)譜信息，與PeakView軟件中標(biāo)志物的二級質(zhì)譜信息進(jìn)行匹配，確定標(biāo)志物的分子式結(jié)構(gòu)。

1.3.6 靶標(biāo)代謝物鑒定

通過查找文獻(xiàn)中瑪咖存在的代謝物建立瑪咖代謝物數(shù)據(jù)庫（表2），將數(shù)據(jù)庫中化合物的分子式和離子加合方式輸入PeakView軟件中的內(nèi)置XIC manager插件中并導(dǎo)入樣品數(shù)據(jù)，軟件根據(jù)化合物分子質(zhì)量和同位素的誤差情況計算待分析樣品中該化合物的質(zhì)譜信息，并且匹配出液相色譜的豐度和出峰時間[51]。其他參數(shù)的設(shè)置：峰面積大于1 000，信噪比大于10，同位素峰的豐度應(yīng)滿足在理論分布范圍的20%內(nèi)。通過PeakView軟件可以得到化合物的一級和二級質(zhì)譜信息，去除沒有一級或二級質(zhì)譜信息的化合物，將化合物的一級和二級質(zhì)譜信息與PubChem、Metlin等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對確認(rèn)。

表2 文獻(xiàn)中的瑪咖代謝物Table 2 Maca metabolites reported in the literature

續(xù)表2

2 結(jié)果與分析

2.1 超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜代謝組學(xué)分析

如圖1所示，不同產(chǎn)地瑪咖的出峰時間大體一致，但出峰數(shù)量和豐度存在差異。秘魯、四川和云南產(chǎn)地的瑪咖出峰數(shù)量相對較多，四川瑪咖在12～16 min豐度很高，秘魯瑪咖在5～6 min豐度較高，說明不同產(chǎn)地代謝物組分種類和含量都具有一定的差異。

圖1 不同產(chǎn)地瑪咖的超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜基峰圖Fig. 1 UPLC-QTOF-MS base peak chromatograms for Maca from different origins

2.2 化學(xué)計量學(xué)分析

經(jīng)過數(shù)據(jù)挖掘和比對后，為減少信號的冗余并對數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，選擇單一同位素（同位素類型中m/z值最低的信號）的峰進(jìn)行化學(xué)計量學(xué)分析，其他峰去除后在正離子模式下共檢測到731 個峰，負(fù)離子模式下檢測到240 個峰。為能區(qū)分瑪咖的各個產(chǎn)地，在正負(fù)離子模式下分別進(jìn)行無監(jiān)督PCA，但結(jié)果表明各產(chǎn)地瑪咖廣泛分散，沒有明確的劃分（圖2A、B）。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行有監(jiān)督的OPLS-DA（圖2C、D），45 份瑪咖可以根據(jù)產(chǎn)地來源被分成5 組，秘魯組（n=9）、云南組（n=9）、四川組（n=9）、新疆組（n=9）、西藏組（n=9）。圖2E、F中各點代表檢測到的各個峰，越靠近原點的離子表示各產(chǎn)地均能檢測到，越靠近外面的離子代表各產(chǎn)地的差異性離子。正離子模式下的OPLS-DA模型驗證后RX2為0.879，RY2為0.964，Q2為0.773，負(fù)離子模式下的OPLS-DA模型驗證后RX2為0.884，RY2為0.856，Q2為0.727，理論上，R2、Q2的值越接近1說明模型越可靠，通常情況下兩者均大于0.5且兩者的差值小于0.3較好。相比較，正離子模式下模型具有較好的可靠性和預(yù)測性。結(jié)果表明基于代謝組學(xué)技術(shù)的液相色譜-質(zhì)譜方法可以用于瑪咖產(chǎn)地的區(qū)分。與負(fù)離子模式相比，正離子模式下的OPLS-DA模型有較好聚類結(jié)果，同時正離子模式下檢測到更多的峰，因此選擇正離子模式采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行代謝物的鑒定。

圖2 不同產(chǎn)地瑪咖的PCA圖Fig. 2 Principal component analysis of Maca from different origins

2.3 非靶標(biāo)代謝產(chǎn)物鑒定

標(biāo)志物經(jīng)過篩選后由Formula Finder軟件根據(jù)母離子的精確質(zhì)量數(shù)、母離子同位素組成以及碎片離子的信息進(jìn)行元素組成的確定。該軟件能夠根據(jù)“MS排名”和“MS/MS排名”對所推導(dǎo)的分子式進(jìn)行排序，排名靠前的分子式比較準(zhǔn)確。同時，該軟件能夠反映理論計算和實驗的同位素組成差異和離子m/z值的差異。實驗中推測得到的分子式的質(zhì)量誤差小于5×10-6，具有較高的可信度。實驗推測得到的分子式輸入到在線數(shù)據(jù)庫（HMDB、Metlin等）中進(jìn)行候選參考化合物的篩選。本研究中用到的Fragment Pane軟件能夠獲得每個候選分子可能的質(zhì)譜碎裂方式，增加了選擇正確離子的可能性。Fragment Pane軟件能夠通過基于化學(xué)智能的碎片峰匹配算法對鑒定的化合物進(jìn)行確認(rèn)。最后鑒定到的不同產(chǎn)地的標(biāo)志物結(jié)果如表3所示。其中，鑒定得到2 個西藏產(chǎn)地的標(biāo)志物，3 個秘魯產(chǎn)地的標(biāo)志物。由于數(shù)據(jù)庫無法匹配到其他化合物對應(yīng)的結(jié)構(gòu)式，因此無法鑒定出它們的結(jié)構(gòu)。但二級質(zhì)譜信息已知，保留該標(biāo)志物，標(biāo)記為unknown。

表3 不同產(chǎn)地瑪咖中的標(biāo)志物Table 3 Markers of Maca from different geographical origins

2.4 靶標(biāo)代謝產(chǎn)物鑒定

表4 通過靶標(biāo)代謝組學(xué)分析鑒定出的瑪咖代謝物Table 4 Maca metabolites identified by target metabolomics analysis

傳統(tǒng)的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理方法是數(shù)據(jù)經(jīng)過處理后，對每個峰都進(jìn)行測定，得到一級和二級質(zhì)譜信息后再進(jìn)行分析鑒定，此方法比較耗時，而且數(shù)據(jù)庫的代謝物種類有限，有很多代謝物在數(shù)據(jù)庫中無法查到二級質(zhì)譜信息。本研究采用逆向鑒定代謝物模式，首先通過查找文獻(xiàn)中已鑒定的瑪咖代謝物，建立理論代謝物數(shù)據(jù)庫（表2），將其輸入到PeakView的XIC manager中與實驗數(shù)據(jù)的精確質(zhì)量數(shù)和同位素類型匹配情況進(jìn)行比較得到瑪咖的可能代謝物。這種方法的最大優(yōu)點是可以快速匹配理論數(shù)據(jù)庫與待測物，篩查到瑪咖的代謝物。本研究在不同產(chǎn)地瑪咖中共鑒定出了28 種代謝物，包括13 種瑪咖酰胺、3 種瑪咖烯、3 種芥子油苷、2 種生物堿、3 種甾醇、1 種多酚、3 種黃酮（表4），均為瑪咖常見的代謝物，表明此方法覆蓋度較好。

2.5 代謝物差異性分析

圖3 XIC manager瑪咖中靶標(biāo)代謝產(chǎn)物熱度圖Fig. 3 Heat analysis of targeted Metabolites of Maca

如圖3所示，顏色代表了代謝物的豐度高低，顏色由綠色到黑色再到紅色代表著代謝物豐度逐漸升高。結(jié)果顯示，瑪咖酰胺和瑪咖烯在5 個產(chǎn)地的瑪咖中均檢測到，且在所有代謝物中豐度較高，表明這2 種代謝物是瑪咖中的主要代謝物質(zhì)。其中四川、西藏、云南3 個產(chǎn)地的瑪咖酰胺含量相對較高，秘魯?shù)默斂┖蜕飰A3-芐基-1,2-二氫-N-羥基吡啶-4-甲醛含量最高，西藏的豆甾醇和菜子甾醇含量較高，新疆的黃酮類物質(zhì)含量較高。熱圖直觀呈現(xiàn)了代謝物在各個產(chǎn)地的分布情況。瑪咖酰胺和瑪咖烯是瑪咖中特有的活性成分，瑪咖酰胺是由氨基化合物與不同脂肪酸形成的酰胺類生物堿，在提高生育力、保護(hù)神經(jīng)等方面功效顯著?，斂┦且环N長鏈不飽和脂肪酸，是引起性功能改善的主要物質(zhì)。瑪咖酰胺和瑪咖烯對于瑪咖的質(zhì)量評價有重要的參考價值。Pan Yu等[29]利用高效液相層析、液相色譜-質(zhì)譜的方法研究了不同產(chǎn)地的瑪咖酰胺含量的差異，共鑒定出12 種瑪咖酰胺，其中N-芐基-9-氧代-12Z,15Z-十八碳二烯酰胺、N-芐基-13-氧代-9E,11E-十八碳二烯酰胺和N-芐基-9Z,12Z-十八碳二烯酰胺在本研究未鑒定出來，其余9 種均鑒定得到，在此基礎(chǔ)上又鑒定出N-芐基辛酰胺、N-芐基-十五酰胺、N-芐基-5-氧代-6E,8E-十八碳二烯酰胺、N-芐基-15Z-二十四烷酰胺4 種瑪咖酰胺。

本研究中5 個產(chǎn)地瑪咖中檢測到的瑪咖酰胺和瑪咖烯種類一致，秘魯產(chǎn)地N-芐基-十六酰胺含量較高，剩余12 種瑪咖酰胺含量相對于其他4 個產(chǎn)地相對較低，而3 種瑪咖烯含量相比于其他4 個產(chǎn)地相對較高。四川產(chǎn)地中N-芐基-5-氧代-6E,8E-十八碳二烯酰胺和N-芐基-9-氧代-12Z-十八碳烯酰胺含量相對較高，新疆產(chǎn)地的各化合物豐度相對較低，西藏產(chǎn)地N-芐基-十六酰胺、N-芐基9Z-十八碳烯酰胺、N-芐基-9Z,12Z,15Z-十八碳三烯酰胺、N-(間甲氧基芐基)-9Z,12Z-十八碳二烯酰胺和N-芐基十八烷酰胺含量較高，云南產(chǎn)地N-芐基-十六酰胺、N-芐基9Z-十八碳烯酰胺和N-芐基-9Z,12Z,15Z-十八碳三烯酰胺含量較高（圖4）。上述研究結(jié)果表明不同產(chǎn)地的瑪咖代謝物分布存在差異。

圖4 不同產(chǎn)地瑪咖的瑪咖酰胺和瑪咖烯類化合物比較Fig. 4 Comparison of macaamide and macaene compounds of Maca from different geographical origins

3 結(jié) 論

已有研究大多以瑪咖酰胺一類代謝物進(jìn)行產(chǎn)地的區(qū)分，忽略了其他代謝物的產(chǎn)地差異。本研究采用基于超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜的代謝組學(xué)方法結(jié)合OPLS-DA成功區(qū)分了瑪咖產(chǎn)地，分析了各個產(chǎn)地的瑪咖多種代謝物，更加全面地闡述了產(chǎn)地對代謝物產(chǎn)生的影響。利用非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析鑒定出15 種產(chǎn)地標(biāo)志物，可用于瑪咖產(chǎn)地的區(qū)分。利用靶標(biāo)代謝組學(xué)分析共鑒定出28 種瑪咖代謝物，其豐度以熱圖形式呈現(xiàn)，反映了代謝物在不同產(chǎn)地的分布情況。瑪咖中豐度較高的代謝物為瑪咖酰胺和瑪咖烯，其次為生物堿和甾醇。結(jié)果證明代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法可以為瑪咖的產(chǎn)地鑒別提供依據(jù)。