藍(lán)蔚青，車 旭，鞏濤碩，張墨言，孫曉紅,*，肖 蕾，謝 晶,*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，食品科學(xué)與工程國家級實驗教學(xué)示范中心（上海海洋大學(xué)），上海 201306）

金槍魚為鱸形目鯖科大洋性高洄游性魚類，主要分布在太平洋、大西洋、印度洋溫帶、熱帶與亞熱帶水域，大多棲息于大洋上層[1]。其肉質(zhì)滑嫩鮮美，富含糖類、蛋白質(zhì)、膽固醇、VA、VD、VE和鈣、磷、鐵、鈉、鉀、鎂、鋅、銅等，尤其以二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapntemacnioc acid，EPA）等n-3多不飽和脂肪酸含量極高[2-3]，被國際營養(yǎng)組織推薦為世界三大營養(yǎng)魚類之一[4]。近年來聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織列出了7 種世界主要捕撈金槍魚類，分別為大目金槍魚、黃鰭金槍魚、長鰭金槍魚、馬蘇金槍魚、北方藍(lán)鰭金槍魚、太平洋藍(lán)鰭金槍魚與鰹魚[5]。其中，大目金槍魚（Thunnus obesus）屬瘦肉型金槍魚，產(chǎn)量較高，也是制作生魚片的主要魚種。然而，大目金槍魚在流通過程中由于溫度及環(huán)境的影響，極易受到微生物的生長代謝而導(dǎo)致其腐敗變質(zhì)，產(chǎn)生異味。新鮮魚肉樣品中的微生物種類復(fù)雜，然而隨著流通時間的延長，僅有少數(shù)適應(yīng)生長的特定優(yōu)勢腐敗菌會使魚樣產(chǎn)生異味腐敗物質(zhì)。其在流通過程中生長代謝力旺盛，致腐能力強，可加速蛋白質(zhì)、脂肪與核苷酸物質(zhì)等的降解，導(dǎo)致生物胺與有機酸等物質(zhì)產(chǎn)生，釋放出不良?xì)馕秾?dǎo)致魚肉腐敗變質(zhì)。目前，國內(nèi)外研究人員主要針對金槍魚冷藏期間的微生物多樣性進(jìn)行分析，如劉愛芳等[6]研究得出大目金槍魚在冷藏條件下假單胞菌的致腐能力較強，其次是熱死環(huán)絲菌與不動桿菌。而對其流通期間的微生物多樣性研究較少，且分析方法相對單一。

高通量測序技術(shù)也稱“下一代”測序技術(shù)，以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定和一般讀長較短等為標(biāo)志，是微生物領(lǐng)域中重要的研究方法，具有測序通量高與結(jié)果精準(zhǔn)等優(yōu)點，現(xiàn)已成為微生物領(lǐng)域中重要的研究課題之一[7-9]。因此，雖然該技術(shù)建立時間不長，但發(fā)展迅速，現(xiàn)已應(yīng)用于基因組，包括測序、表觀基因組學(xué)與功能基因組學(xué)研究等方面[10]。高通量測序能將待測樣品中不可培養(yǎng)的微生物、低豐度的微生物檢測出，從而更好反映樣品中微生物的種群結(jié)構(gòu)特征，能使待測樣品的菌群結(jié)構(gòu)分析得更加全面[11]。近年來，陸續(xù)有相關(guān)學(xué)者利用高通量技術(shù)進(jìn)行水產(chǎn)品貯藏加工期間菌群結(jié)構(gòu)變化的研究。如Yang Shengping等[12]將高通量與生理生化鑒定相結(jié)合研究常溫（25 ℃）與冷藏（4 ℃）南美白對蝦菌群結(jié)構(gòu)的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)常溫組樣品的優(yōu)勢菌為變形桿菌屬，冷藏組樣品的優(yōu)勢菌為腐敗希瓦氏菌、約氏不動桿菌與溫和氣單胞菌；Zhang Yuemei等[13]研究得出冷藏鯉魚片經(jīng)肉桂精油處理后，其菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，貯藏末期的優(yōu)勢菌為氣單胞菌屬與乳球菌屬，而肉桂精油處理并經(jīng)真空包裝后，其氣單胞菌屬相對豐度較低；Zhan Huang等[14]研究發(fā)現(xiàn)冷藏草魚片的優(yōu)勢菌為假單胞菌屬、氣單胞菌屬、希瓦氏菌屬與不動桿菌屬，桂皮精油處理能使草魚片貯藏期間的菌相組成發(fā)生顯著改變，使假單胞菌屬成為處理組草魚片的優(yōu)勢菌，并主導(dǎo)其腐??；Zang Jinhong等[15]研究得出腌酸魚發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌為乳酸菌屬、大球菌屬與葡萄球菌屬；而采用高通量測序技術(shù)研究水產(chǎn)品流通期間的菌群變化還鮮有報道。

基于此，本實驗?zāi)M冷鏈與斷鏈兩種流通方式，分別測定大目金槍魚樣品在不同流通階段中的pH值、總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）值、菌落總數(shù)與嗜冷菌數(shù)的變化，通過高通量測序研究其在不同流通條件下的微生物菌群變化規(guī)律，進(jìn)一步分析大目金槍魚在兩種流通過程中的主要優(yōu)勢菌，以期為水產(chǎn)品流通保鮮提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大目金槍魚由浙江豐匯遠(yuǎn)洋漁業(yè)有限公司于2017年6月捕撈于太平洋近海，經(jīng)船上屠宰冷凍后直接抽真空凍藏于-55 ℃，購自上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院。

平板計數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）、輕質(zhì)氧化鎂、鹽酸、硼酸、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；TIANamp Stool DNA Kit試劑盒 德國Qiagen生化試劑有限公司；75510-019瓊脂糖凝膠試劑、Marker（DL15000）、瓊脂糖凝膠電泳緩沖液 美國英杰生命技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nanodrop型紫外定量儀 美國Thermo Scientific儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一生物科技有限公司；BG-gdsAUTO(130)型凝膠成像系統(tǒng) 北京百晶生物技術(shù)有限公司；2720型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀 美國ABI儀器有限公司；FLX800T型酶標(biāo)儀 美國BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗設(shè)計

將大目金槍魚樣品分別進(jìn)行冷鏈（CK）與斷鏈（L1）兩種流通方式處理，具體如下：

CK組：CS1為-55 ℃貯藏120 h；CS2為-55 ℃貯藏192 h；SM-HR為經(jīng)CS2處理后，再經(jīng)4 ℃、24 h冷藏存放（家庭冷藏）。

L1組：SM為-55 ℃貯藏120 h后，再經(jīng)2 ℃、24 h貯藏（超市售賣）；SM-FF為樣品經(jīng)SM處理后轉(zhuǎn)入-18 ℃、24 h貯藏（超市凍藏）；SM-RS為經(jīng)過SM-FF處理后重新2 ℃冷藏柜銷售24 h（超市二次售賣）；R-FT為SM-RS處理后轉(zhuǎn)入4 ℃、24 h冷藏（家庭冷藏）。

圖1 大目金槍魚流通過程設(shè)計路線圖Fig. 1 Temperature fluctuations during different circulation processes

如圖1所示，CK組樣品選取3 個關(guān)鍵點（CS1、CS2、SM-HR），L1組樣品選取4 個關(guān)鍵點（SM、SM-FF、SMRS、R-FT）分別進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定與高通量分析。

1.3.2 pH值測定

取剁碎的大目金槍魚肉5 g于燒杯中，加45 mL蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，靜置30 min后用pH計進(jìn)行測定[16]。每組樣品平行測定3 次。

1.3.3 TVB-N值測定

參考GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[17]，根據(jù)半微量凱氏定氮原理利用自動凱氏定氮儀進(jìn)行測定。每組樣品平行測定3 次。

1.3.4 菌落總數(shù)與嗜冷菌數(shù)測定

在無菌工作臺稱取10 g大目金槍魚肉，放入無菌均質(zhì)袋中，加入90 mL無菌生理鹽水后均質(zhì)機拍打5 min，取1 mL于試管中10 倍稀釋；選取3 個最適濃度的稀釋液，移取1 mL稀釋液于滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，傾注培養(yǎng)基，并輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使其混合均勻。待其凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，置于恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如表1所示，每個稀釋度做3 個平行。

表1 大目金槍魚流通期間的菌落總數(shù)與嗜冷菌數(shù)培養(yǎng)條件Table 1 Culture conditions for TVC and Psychrobacter count

1.3.5 兩種流通方式在不同流通階段樣品的總DNA提取與PCR擴增

不同流通時期大目金槍魚樣品先用滅菌的PBS（pH 7.4）充分洗滌，洗滌液在4 ℃、2 000 r/min離心5 min，取上清液再次于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集沉淀。再用PBS充分洗滌收集沉淀，移入干凈的離心管中，按TIANamp Stool DNA Kit試劑盒要求進(jìn)行操作，完成樣品中細(xì)菌DNA提取，分別使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測提取DNA，最后將DNA溶液于-20 ℃保存?zhèn)溆?。通用引物選擇序列V3-V4通用引物（前引物序列：ACTCCTACGGGAGGCAGCA；后引物序列：GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。

隨后進(jìn)行PCR擴增，第1輪PCR步驟：94 ℃驟熱啟動3 min；94 ℃、30 s變性，45 ℃、20 s退火，65 ℃、30 s延伸，5 個循環(huán)；隨后94 ℃、20 s變性，55 ℃、20 s退火，72 ℃、30 s延伸，20 個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。第2輪PCR步驟：95 ℃驟熱啟動3 min；94 ℃、20 s變性，55 ℃、20 s退火，72 ℃、30 s延伸，5 個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。2 輪PCR擴增體系如表2所示。2 輪PCR擴增結(jié)束后取3 μL PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，具體為樣品與Marker上樣量5 μL、電壓120 V、電流80 mA、電泳時間20 min。

表2 PCR擴增體系Table 2 PCR reaction system

1.3.6 樣品DNA純化回收

參考Caporasoa等[20]方法對細(xì)菌擴增的PCR產(chǎn)物和正常擴增片段在400 bp以上的PCR產(chǎn)物，選用0.6 倍的磁珠（Agencourt AMPure XP）處理。在25 μL PCR產(chǎn)物中加入體積0.6 倍的磁珠，振蕩充分懸浮后放在磁力架上吸附5 min，移液槍吸出上清液；加入30 μL 0.6 倍的磁珠洗滌液，振蕩充分后放在磁力架上吸附5 min，吸出上清液；加入90 μL WashBuffer，反向置于磁力架上，使磁珠吸附到PCR管另一面，充分吸附后吸出上清液；將其放在55 ℃烘箱中處理5 min，再加入30 μL Elution Buffer洗脫；將PCR管放在吸附架上5 min，充分吸附，移出上清液到離心管中，定量備用。

1.3.7 兩種流通方式在不同流通階段樣品的高通量測序

將定量好的DNA文庫樣本送至派森諾生物（上海）股份有限公司進(jìn)行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均采用3 次平行實驗的平均值，數(shù)據(jù)用軟件Origin(Pro)8.5繪制曲線，數(shù)據(jù)間差異通過統(tǒng)計軟件SPSS19.0中的Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析與多重比較，結(jié)果以表示。對測序得到的數(shù)據(jù)在測序平臺進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種流通方式在不同流通階段樣品的pH值測定結(jié)果

水產(chǎn)品在貯藏期間的pH值變化會出現(xiàn)先降后升的變化趨勢，可能由于原料捕獲宰殺貯藏期間，先后經(jīng)歷僵硬、解僵、自溶與腐敗等階段。僵直期間其中的ATP分解產(chǎn)生乳酸、丙酮酸、磷酸等酸性物質(zhì)，使其pH值有所下降。后期魚肉中的蛋白質(zhì)及其部分含氮物質(zhì)會被分解成氨基酸、氨、三甲胺、硫化氫、吲哚等堿性物質(zhì)，導(dǎo)致樣品的pH值逐漸上升[21]。

圖2 流通方式對大目金槍魚pH值變化的影響Fig. 2 Changes in pH value in big-eye tuna during different circulation processes

從圖2可看出，L1組樣品的pH值低于CK組，CK組變化平緩，L1組則呈明顯先降后升趨勢。說明在低溫條件下魚肉中微生物活動受到抑制，酸性物質(zhì)等釋放較少，因此pH值無顯著變化。而L1組樣品在168 h前的pH值降幅明顯，說明魚肉從解凍開始微生物活動旺盛，使酸性物質(zhì)大量分解，168 h后樣品的pH值緩慢上升說明此時氨及胺類物質(zhì)逐漸被釋放。李雙雙[22]研究了不同濃度生物保鮮劑對-18 ℃凍藏黃鰭金槍魚品質(zhì)變化影響，其實驗結(jié)果與本研究結(jié)果變化趨勢相一致。因此，溫度波動對微生物產(chǎn)生影響，導(dǎo)致其pH值變化劇烈[23]。

2.2 兩種流通方式在不同流通階段樣品的TVB-N值測定結(jié)果

魚肉貯藏過程中由于微生物及魚體內(nèi)源酶的共同作用，魚肉蛋白質(zhì)發(fā)生降解，產(chǎn)生胺類物質(zhì)，導(dǎo)致其TVB-N值升高，該值與魚體鮮度相關(guān)性好，是常用的判斷水產(chǎn)品腐敗程度的標(biāo)準(zhǔn)之一[23]。TVB-N值越高，表明樣品的腐敗程度越嚴(yán)重。

圖3 流通方式對大目金槍魚TVB-N值變化的影響Fig. 3 Changes in TVB-N value in big-eye tuna during different circulation processes

由圖3可知，兩組樣品在貯藏前期的TVB-N值差異不明顯，從144 h后，對照組樣品TVB-N值開始緩慢上升，而L1組樣品相較于CK組，其值明顯偏高?？赡苡捎隰~肉在低溫條件下，微生物生長被抑制。其中，CK組樣品在216 h時，其TVB-N值仍保持較低水平，而L1組樣品在168 h后顯著增長，216 h時達(dá)（16.05±0.17）mg/100 g，超出鮮度水平，處于不可接受狀態(tài)。因此，大目金槍魚樣品的TVB-N值隨著貯藏溫度與流通時間的延長相應(yīng)增加，當(dāng)流通溫度達(dá)2 ℃與4 ℃時，其TVB-N值的上升幅度明顯加劇。Hozbor等[24]研究發(fā)現(xiàn)TVB-N與細(xì)菌性腐敗有關(guān)。湯元睿等[25]研究了冷鏈物流過程中溫度變化對大目金槍魚新鮮度的影響，結(jié)果得出溫度變化可能加快細(xì)菌繁殖，導(dǎo)致TVB-N值升高，魚肉腐敗加速。

2.3 兩種流通方式在不同流通階段樣品的菌落總數(shù)與嗜冷菌數(shù)測定結(jié)果

菌落總數(shù)對水產(chǎn)品在貯藏過程中品質(zhì)的影響特別明顯，由微生物生長和新陳代謝所造成的水產(chǎn)品損失可達(dá)30%。菌落總數(shù)的變化可反映樣品中的蛋白質(zhì)和氨基酸分解代謝情況，反映其腐敗程度。金槍魚生食標(biāo)準(zhǔn)提出可食用的菌落總數(shù)上限為4.0（lg（CFU/g））[26]。由圖4所示，CK組樣品的菌落總數(shù)在168 h后開始增長，216 h后菌落總數(shù)達(dá)（3.51±0.19）（lg（CFU/g）），此時金槍魚已接近生食限值。而L1組樣品在168 h時超過生食限值，可能由于2 ℃與4 ℃時，溫度波動相對劇烈，且在銷售溫度2 ℃細(xì)菌生長加劇。徐慧文等[27]研究了冰藏和冷藏條件下大目金槍魚品質(zhì)變化影響表明，與冷藏處理相比，冰藏能有效抑制微生物的增殖，更有利于延緩樣品品質(zhì)的劣變，其研究結(jié)果驗證了本研究的菌落總數(shù)變化特點。

圖4 流通方式對大目金槍魚菌落總數(shù)與嗜冷菌數(shù)變化的影響Fig. 4 Changes in TVC and PC in big-eye tuna during different circulation processes

在菌落總數(shù)中，嗜冷菌一般占10%以上。人們在生產(chǎn)中采取低溫保藏的方式抑制微生物生長繁殖，嗜溫菌與嗜熱菌等的生長繁殖在低溫貯藏過程中受到抑制，而嗜冷菌能在低溫環(huán)境中能正常生長，因而逐漸成為優(yōu)勢菌株。由于嗜冷菌種類繁多，其菌落組成很大程度決定了生鮮食品的質(zhì)量[28]。由圖4可知，樣品在低溫流通過程中，其嗜冷菌始終存在，在-55 ℃超低溫條件下相對較少，而從-18 ℃開始有明顯增長。隨著溫度波動的加劇，兩組樣品的嗜冷菌數(shù)均顯著增加，L1組樣品的嗜冷菌數(shù)始終高于CK組樣品。216 h后兩組樣品的嗜冷菌數(shù)分別為（3.03±0.21）（lg（CFU/g））與（5.64±0.24）（lg（CFU/g））。嗜冷菌的變化趨勢與菌落總數(shù)基本一致，因此導(dǎo)致樣品發(fā)生腐敗。

2.4 兩種流通方式在不同流通階段樣品的PCR擴增結(jié)果

對兩種流通方式在不同階段的7 個樣品分別進(jìn)行樣本總DNA提取，在16S RNA V3-V4區(qū)基因擴增，并對PCR擴增結(jié)果進(jìn)行膠回收，擴增片段大小為500 bp，以獲得樣本文庫，如表3所示。

表3 大目金槍魚樣本PCR產(chǎn)物定量結(jié)果Table 3 Quantitative results of total microbial DNA from big-eye tuna with PCR ampli fi cation

從表3可看出，大目金槍魚的PCR產(chǎn)物定量分析結(jié)果不高，表明其DNA濃度低，但仍可開展后續(xù)研究。

2.5 兩種流通方式在不同流通階段樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)差異比較

通過對兩種流通方式7 個樣本的有效基因序列在軟件中進(jìn)行分析，根據(jù)各個樣本中細(xì)菌種類組成繪制成柱狀圖。圖5顯示在細(xì)菌屬水平上分析兩種不同流通過程中在不同溫度及不同流通時間下的變化情況，圖中各種細(xì)菌種類的比例代表不同階段細(xì)菌活性的狀態(tài)。

圖5 不同流通方式樣品在屬水平上微生物群落結(jié)構(gòu)組成差異Fig. 5 Difference in microbial population structure during different circulation processes at the genus level

由圖5可知，CK組（CS1、CS2與SM-HR）細(xì)菌種類相似，其中SM-HR與CS1、CS2相比，有略微上升趨勢。說明在冷鏈過程中保持-55 ℃細(xì)菌種類與菌數(shù)相對不變。后期由于樣品在216 h時溫度達(dá)到4 ℃，流通溫度時有一定增長，表明溫度波動使細(xì)菌種類與菌數(shù)上升。SM-HR的優(yōu)勢菌主要為熱死環(huán)絲菌（Brochothrix thermosphacta）、內(nèi)生菌（Endophytes）、雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）、不動桿菌屬（Acinetobacterspp.）、芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）與假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）；而R-FT的主要菌為熱死環(huán)絲菌、內(nèi)生菌、雷爾氏菌、不動桿菌屬、溶桿菌（Lysobacter）、假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonasspp.）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacterspp.）與希瓦氏菌屬（Shewanellaspp.），其假單胞菌與嗜冷桿菌都占有相當(dāng)比例，前期通過對不同流通階段樣品嗜冷菌數(shù)的測定結(jié)果進(jìn)一步驗證了后期高通量測定結(jié)果，其綜合變化趨勢與劉愛芳等[6]研究結(jié)果一致。因此，大目金槍魚流通期間需合理控制溫度波動，抑制微生物生長繁殖。

2.6 兩種流通方式在不同流通階段樣品的主成分分析

主成分分析可反映樣本間分析組分的差異，主成分分析相應(yīng)坐標(biāo)軸上樣本距離越近，其分析組分間的相似性越高[29]。其中，高乾坤等[30]采用主成分分析法分析了不同產(chǎn)地帶魚冷藏期間的細(xì)菌群落差異，表明不同產(chǎn)地樣品間菌群結(jié)構(gòu)變化明顯，也充分說明了將其應(yīng)用于高通量測序結(jié)果分析的可行性。

圖6 不同流通方式對大目金槍魚樣品菌群結(jié)構(gòu)變化的主成分分析Fig. 6 Principal component analysis of changes in microbial population in big-eye tuna during different circulation processes

如圖6所示，主成分1貢獻(xiàn)率為51.86%；主成分2貢獻(xiàn)率為32.38%。這2 個主成分是兩種不同流通方式在不同階段樣品微生物群落結(jié)構(gòu)組成差異的主要因子[31]。在主成分1方向上，CK組樣品CS1、CS2與L1組樣品SM的樣本點分布差異不大，而其與L1組樣品R-FT差異十分顯著，說明流通方式與流通階段在主成分1水平上對樣品菌群結(jié)構(gòu)變化影響顯著；在主成分2水平上，各組樣品在不同流通階段中的分布區(qū)域十分明顯，CK組樣品的樣本點基本上分布于Y軸的下方，L1組樣品的樣本點分布于Y軸的上方，即主成分2是解釋各組樣品在不同流通階段中菌群結(jié)構(gòu)變化的主要成分，該研究結(jié)果與高通量群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果基本一致。

3 結(jié) 論

CK組微生物變化不顯著，其在216 h時各項指標(biāo)僅有較小增幅；L1組樣品在流通期間的品質(zhì)指標(biāo)與CK組差異顯著，其pH值呈先降后升的變化趨勢，TVB-N值、菌落總數(shù)與嗜冷菌數(shù)增幅顯著。其在-55 ℃、120 h，-18 ℃、24 h，2 ℃、24 h后趨勢明顯，樣品在流通168 h后超出生食標(biāo)準(zhǔn)。

SM-HR優(yōu)勢菌主要為熱死環(huán)絲菌、內(nèi)生菌、雷爾氏菌、不動桿菌屬、芽孢桿菌屬與假單胞菌屬；而R-FT的主要菌為熱死環(huán)絲菌、內(nèi)生菌、雷爾氏菌、不動桿菌屬、溶桿菌、假交替單胞菌屬、嗜冷桿菌屬與希瓦氏菌屬。主成分分析結(jié)果可用于表征兩種流通方式在不同流通階段大目金槍魚樣品間的菌群結(jié)構(gòu)差異。