黃 翔,陶 蕾,楊 燃,黃 群,*,安鳳平,黃 茜,馬美湖
(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430070)
我國(guó)是世界禽蛋生產(chǎn)和消費(fèi)第一大國(guó),每年廢棄的雞蛋殼約300萬(wàn) t[1],造成嚴(yán)重的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。蛋殼鈣是一種理想的膳食鈣源,提自蛋殼粉的鈣比商業(yè)碳酸鈣在大鼠小腸中更易吸收[2]。蛋殼鈣可用于人體和動(dòng)物骨礦化和生長(zhǎng)的缺鈣治療[3],以及作為牙膏的抗牙垢劑[4]。食品工業(yè)利用蛋殼鈣制備的乳酸鈣作為固化劑、調(diào)味劑、膨松劑及抗菌劑[5]。
乳酸鈣、檸檬酸鈣和葡萄糖酸鈣等有機(jī)酸鈣制劑的高效制備為當(dāng)前研究熱點(diǎn)[6]。乳酸鈣是補(bǔ)充和強(qiáng)化骨骼鈣的理想添加劑,廣泛用于醫(yī)藥、食品和飼料工業(yè)[7]。蛋殼含有豐富的碳酸鈣,可作為鈣源制備有機(jī)酸鈣,目前主要方法有高溫煅燒法、直接中和法與微生物發(fā)酵法[8]。高溫煅燒法和直接中和法能耗大,鈣轉(zhuǎn)化率較低,工業(yè)化生產(chǎn)成本高。微生物發(fā)酵法耗能低、不易對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染、制備工藝條件簡(jiǎn)單,更適于制備乳酸鈣[9]。
微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化蛋殼鈣為乳酸鈣的常用微生物為乳酸菌,乳酸菌能利用糖類發(fā)酵產(chǎn)生乳酸[10]。復(fù)合乳酸菌可以利用不同乳酸菌的生理生化特點(diǎn),互為對(duì)方提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境,并達(dá)到代謝產(chǎn)物的互補(bǔ)。已有研究[11-12]使用復(fù)合菌種發(fā)酵蘋果山藥果蔬汁,發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌種發(fā)酵最終產(chǎn)酸量和產(chǎn)品品質(zhì)明顯要優(yōu)于單一菌株,發(fā)酵能力和抑菌效果也優(yōu)于單株乳酸菌。利用4 種乳酸菌復(fù)合發(fā)酵蛋殼制備乳酸鈣的研究鮮見報(bào)道,本研究選取乳酸產(chǎn)量相對(duì)較高的蒙氏腸球菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌4 種乳酸菌復(fù)合發(fā)酵蛋殼生物制備乳酸鈣,利用響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化,以提高轉(zhuǎn)化效益與乳酸鈣產(chǎn)量,為后續(xù)乳酸菌發(fā)酵法回收利用廢棄蛋殼制備乳酸鈣提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
雞蛋殼收集于福建農(nóng)林大學(xué)蛋糕店。蒙氏腸球菌(Enterococcus mundtii)和保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)蛋品加工國(guó)家地方工程實(shí)驗(yàn)室貯藏,嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus,保藏編號(hào)CICC 20382)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei,保藏編號(hào)CICC 20282)購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
MRS(Man Rogosa Sharpe)、MRS瓊脂培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司;鈣黃綠素(分析純) 上海麥克林生化科技有限公司。
YF-150B中藥材粉碎機(jī) 瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司;TGL-16冷凍離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司;GI65DS高壓蒸汽滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司;GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;ZWYR-240恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司;AVATAR360傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)尼高力儀器公司;DY5261型X射線多晶衍射儀 美國(guó)CEM公司。
1.3.1 蛋殼粉制備
蒸餾水清洗后的蛋殼于70 ℃電熱恒溫干燥箱中干燥3 h,隨后放入連續(xù)式高性能粉碎機(jī)中粉碎。將蛋殼粉加入蒸餾水浸泡,攪拌10 min后靜置15 min,除去上液漂浮的蛋殼膜。蛋殼粉抽濾后在70 ℃干燥3 h,過(guò)200 目篩后收集備用。
1.3.2 培養(yǎng)基與菌種活化
發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨0.5 g,胰蛋白胨0.5 g,酵母提取物1.0 g,鹽溶液(NaHCO310.0 g、NaCl 2.0 g、無(wú)水CaCl20.2 g,K2HPO41.0 g、KH2PO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.48 g,定容至1 000 mL)4 mL,葡萄糖12 g,蛋殼粉8 g,蒸餾水100 mL。培養(yǎng)基成分充分混均后,121 ℃滅菌20 min,蛋殼粉單獨(dú)滅菌,冷卻后備用。
菌種活化:4 株菌種(蒙氏腸球菌、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌)分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中,于37 ℃培養(yǎng)24 h,2.0%的接種量傳代2~3 次,直至恢復(fù)活力,0~4 ℃冰箱中低溫保藏。
1.3.3 理化指標(biāo)測(cè)定
發(fā)酵液乳酸鈣含量測(cè)定:采用文獻(xiàn)[1 3]的方法;發(fā)酵液殘?zhí)橇繙y(cè)定:采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)比色法[14];乳酸鈣純度測(cè)定:參照參考文獻(xiàn)[15]的方法。
1.3.4 拮抗實(shí)驗(yàn)
將4 種菌兩兩交叉劃線接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)24 h,觀察十字交叉處是否有被抑制而發(fā)生菌落萎縮和消失的現(xiàn)象[10]。
1.3.5 乳酸菌生長(zhǎng)曲線繪制
將活化后的4 種乳酸菌按體積分?jǐn)?shù)2.0%分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng)。前12 h每隔1 h測(cè)定一次,后12 h每隔3 h測(cè)定一次,菌液稀釋10 倍后測(cè)600 nm波長(zhǎng)處OD值,連續(xù)測(cè)定至48 h。MRS液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照,繪制乳酸菌生長(zhǎng)曲線。
1.3.6 發(fā)酵工藝優(yōu)化
1.3.6.1 復(fù)合菌種不同組合對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量的影響
4 種乳酸菌按不同比例相互組合。將各菌液濃度統(tǒng)一調(diào)成1×108CFU/mL,發(fā)酵培養(yǎng)基中依次接入蒙氏腸球菌、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌,接種體積比為1∶1∶1∶1、1∶2∶1∶1、1∶1∶2∶1、1∶1∶1∶2、2∶1∶1∶1等15 種組合。于37 ℃、180 r/min厭氧發(fā)酵72 h,研究4 種菌不同組合發(fā)酵對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量的影響。
1.3.6.2 單因素試驗(yàn)
發(fā)酵溫度的選擇:培養(yǎng)基pH值為7.0,接種量為8.0%,分別在32、34、37、39、42 ℃,180 r/min厭氧發(fā)酵72 h,考察發(fā)酵溫度對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量的影響。
發(fā)酵時(shí)間的選擇:培養(yǎng)基pH值為7.0,接種量為8.0%,于37 ℃、180 r/min條件下厭氧發(fā)酵48、54、60、72、80 h,考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量的影響。
初始pH值的選擇:調(diào)整培養(yǎng)基pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,在接種量為8.0%的條件下,37 ℃、180 r/min厭氧發(fā)酵60 h,考察培養(yǎng)基pH值對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量的影響。
接種量的選擇:向發(fā)酵培養(yǎng)基中依次接入蒙氏腸球菌、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌,設(shè)定各個(gè)菌株的接種量分別為2%、3%、4%、5%、6%,則復(fù)合菌總接種量分別為8.0%、12.0%、16.0%、20.0%、24.0%,接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r/min厭氧發(fā)酵60 h,考察不同菌液接種量對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量的影響。
不同金屬離子及其質(zhì)量濃度的選擇:將MnSO4·H2O、ZnSO4·H2O、MgSO4·7H2O分別配制成質(zhì)量濃度0.01、0.1、1.0 g/L的金屬離子溶液,分別將不同濃度的Mn2+、Zn2+、Mg2+金屬離子溶液添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)基pH 7.0、接種量8.0%的條件下,37 ℃、180 r/min厭氧發(fā)酵60 h,考察不同金屬離子及其質(zhì)量濃度對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量的影響。
1.3.6.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)
綜合考慮單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量影響顯著的3 個(gè)因素發(fā)酵時(shí)間、初始pH值、接種量為考察變量,乳酸鈣產(chǎn)量為響應(yīng)值,通過(guò)響應(yīng)面分析優(yōu)化發(fā)酵條件。應(yīng)用Design-Expert 10.0.7軟件設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn),試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。
表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Coded values and corresponding actual values of independent variables used for response surface design
1.3.7 發(fā)酵液中乳酸鈣的提取
發(fā)酵液含有發(fā)酵產(chǎn)物乳酸鈣、過(guò)剩蛋殼鈣、未發(fā)酵殘?zhí)恰⑸?、蛋白質(zhì)等[16],需對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行除雜處理。發(fā)酵液離心后取上清液,加入氫氧化鈣調(diào)pH值至12~13,80 ℃攪拌30 min。將粗乳酸鈣液過(guò)濾,pH值調(diào)至4~5,加入3.0%~4.0%的粉末活性炭以吸附色素等雜質(zhì),50~60 ℃靜置2 h,真空抽濾濾去活性炭,重復(fù)脫色直至澄清。收集乳酸鈣母液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后,低溫冷卻結(jié)晶,再將晶體溶于蒸餾水中進(jìn)行重結(jié)晶。加入適量無(wú)水乙醇,洗滌乳酸鈣晶體,除去殘余的乳酸及表面附著的其它殘留物。將乳酸鈣產(chǎn)物于80 ℃干燥8 h,達(dá)到質(zhì)量恒定即可粉碎、過(guò)篩得乳酸鈣成品[15]。
1.3.8 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征
1.3.8.1 傅里葉變換紅外光譜分析
將乳酸鈣樣品和溴化鉀粉末于120 ℃干燥4 h,干燥器中冷卻30 min。分別取乳酸鈣樣品和溴化鉀粉末以1∶100的比例置于瑪瑙研缽中充分混合,研磨精細(xì)。研磨混勻的粉末加入制樣模具中壓成幾乎呈透明的圓片后進(jìn)行紅外光譜分析。測(cè)定條件:光譜范圍4 000~400 cm-1;峰-峰值的噪聲為1.3×10-5Abs/min掃描;RMS噪聲為3.6×10-6Abs/min掃描。
1.3.8.2 X射線衍射分析
將乳酸鈣樣品充分干燥后用瑪瑙研缽盡可能研細(xì),然后把試樣粉末均勻撒入制樣框的窗口中,用玻璃片輕壓制成1.5~2.0 mm足夠緊密的平整平面,將乳酸鈣制樣框放入試樣臺(tái)進(jìn)行X射線衍射分析。測(cè)定條件:電壓220 V,頻率50 Hz,連續(xù)掃描,管電流20 mA,管電壓10~40 kV,初始角度10°,終止角度80°。
每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析ANOVA及顯著性差異分析,結(jié)果以±s表示。利用Origin 2017軟件繪圖,選用Design-Expert 10.0.7 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析,P<0.05,差異顯著。
圖1 4 種菌的拮抗實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 1 Antagonistic effects among four strains
如圖1所示,平板上4 種菌均生長(zhǎng)良好,兩兩交叉處無(wú)菌落萎縮或消失現(xiàn)象,說(shuō)明4 種菌之間沒(méi)有拮抗作用,可以用于混菌復(fù)合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
圖2 乳酸菌生長(zhǎng)曲線Fig. 2 Growth curves of lactic acid bacteria
由圖2可知,4 種乳酸菌的延滯期較短,在接種后0~4 h開始緩慢生長(zhǎng),該時(shí)期內(nèi)細(xì)胞繁殖較慢,數(shù)量增長(zhǎng)較少。菌體經(jīng)過(guò)較短的延遲期后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,在4~10 h內(nèi)生長(zhǎng)迅速,呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng),菌種代謝和繁殖加快,酶系活躍,代謝旺盛,培養(yǎng)基內(nèi)菌株生長(zhǎng)速率達(dá)到最大。到12 h時(shí)總菌數(shù)達(dá)到較高水平并基本保持不變,進(jìn)入穩(wěn)定期,菌體生長(zhǎng)速率變化幅度趨于平穩(wěn),活菌數(shù)保持相對(duì)穩(wěn)定,菌落代謝產(chǎn)物不斷積累達(dá)到最高峰。到20 h后進(jìn)入衰亡期,活菌菌體數(shù)量逐漸緩慢減少,菌種活性降低并趨于停滯。
根據(jù)4 種菌株的生長(zhǎng)曲線綜合判斷,菌株接種后12 h活性較高,在12 h時(shí)各菌液的OD值均達(dá)到較大值,適合下一代的接種[17-18]。此后保持相對(duì)穩(wěn)定,說(shuō)明菌液在12 h時(shí)生長(zhǎng)狀況最佳,故本實(shí)驗(yàn)中4 種乳酸菌均選取培養(yǎng)12 h的穩(wěn)定期菌液進(jìn)行接種發(fā)酵。
圖3 復(fù)合菌株組合對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effects of different mixed starter cultures on the yield of calcium lactate
依次按照蒙氏腸球菌、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌的順序接種。由圖3可知,復(fù)合菌種接種量比為1∶1∶2∶1時(shí),乳酸鈣產(chǎn)量最高。對(duì)結(jié)果進(jìn)行的差異顯著性分析表明,接種比為1∶1∶2∶1與1∶2∶2∶1、2∶1∶1∶1無(wú)顯著差異(P>0.05),與其他12 組均有顯著差異。有研究報(bào)道,嗜熱鏈球菌及保加利亞乳桿菌以1∶1接種的發(fā)酵活力最佳[19]。乳酸桿菌屬的干酪乳桿菌是乳酸生產(chǎn)的重要來(lái)源,這可能是將干酪乳桿菌與嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌混合后對(duì)其他乳酸菌起到了互相促進(jìn)生長(zhǎng)的作用[20],達(dá)到理想的發(fā)酵效果。因此復(fù)合菌株接種量比選定為1∶1∶2∶1。
圖4 單因素對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量的影響Fig. 4 Effects of fi ve fermentation parameters on calcium lactate yield investigated by one-factor-at-a-time method
由圖4a可知,隨著發(fā)酵溫度的升高,乳酸鈣產(chǎn)量先升高后下降,發(fā)酵溫度對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量影響顯著。37 ℃時(shí)乳酸鈣產(chǎn)量達(dá)最大值,殘?zhí)橇孔畹?,說(shuō)明復(fù)合乳酸菌利用葡萄糖的效果最好。當(dāng)培養(yǎng)溫度低于37 ℃時(shí),溫度過(guò)低,酶活性受抑制,酶促反應(yīng)減弱,導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)和代謝減緩。但溫度過(guò)高時(shí),會(huì)導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性,核酸降解變性失活[21],故高于37 ℃后乳酸鈣產(chǎn)量降低。復(fù)合乳酸菌的適宜發(fā)酵溫度為37 ℃。
由圖4b可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),乳酸鈣產(chǎn)量逐漸升高,葡萄糖含量逐漸降低。發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量和殘?zhí)橇坑酗@著影響。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)60 h后,乳酸鈣產(chǎn)量增長(zhǎng)緩慢且趨于停止。這是因?yàn)樵?0 h之前隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),乳酸菌數(shù)量不斷增加,利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸含量也逐漸增多,葡萄糖作為乳酸菌生長(zhǎng)發(fā)酵的碳源,生成大量的乳酸鈣。60 h后葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量減少,減緩了乳酸菌的生長(zhǎng)和代謝[22],導(dǎo)致乳酸鈣的產(chǎn)量減少。發(fā)酵時(shí)間以60~72 h為宜。
由圖4c可知,隨著培養(yǎng)基初始pH值的升高,乳酸鈣產(chǎn)量呈現(xiàn)先升高后降低的變化特征。初始pH值對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量有顯著影響。當(dāng)pH值較低時(shí),由于大量氫離子的存在,超過(guò)了乳酸菌保持胞內(nèi)pH值動(dòng)態(tài)平衡的能力,導(dǎo)致膜脂飽和度下降,胞內(nèi)pH值也隨之下降,從而抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)。培養(yǎng)基pH值控制在6.0時(shí),乳酸菌生長(zhǎng)較好,乳酸產(chǎn)量最高,這與乳酸菌生長(zhǎng)的最適pH值一致[23]。當(dāng)pH值超過(guò)6.5后,pH值升高使原來(lái)培養(yǎng)基中離子間的化學(xué)平衡發(fā)生移動(dòng)、生成沉淀,降低了培養(yǎng)基的有效成份,也抑制了乳酸菌的代謝生長(zhǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基pH值以6.0為宜。
由圖4d可知,隨著接種量的增加,乳酸鈣產(chǎn)量逐漸降低。這是因?yàn)榻臃N量過(guò)多時(shí),菌體生長(zhǎng)過(guò)快,微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)增強(qiáng),培養(yǎng)液黏度增加,加速細(xì)胞衰老,導(dǎo)致部分菌體死亡,并且產(chǎn)生過(guò)多代謝廢物,葡萄糖利用降低,發(fā)酵后勁不足,從而影響代謝產(chǎn)物的合成,產(chǎn)酸量隨之下降[24]。發(fā)酵接種量以8.0%為宜。
由圖4e可知,低濃度Mn2+與Mg2+一定程度上可提高乳酸鈣產(chǎn)量,最佳質(zhì)量濃度均為0.1 g/L;而高質(zhì)量濃度會(huì)表現(xiàn)出一定的抑制作用。二價(jià)金屬離子Mn2+、Mg2+是激活金屬酶的必要輔因子,糖酵解途徑的大多數(shù)酶都需要Mg2+的參與,Mg2+含量與正常細(xì)胞的增殖直接相關(guān);Mg2+是葡萄糖激酶、磷酸烯醇化酶、丙酮酸酶等主要酶的激活劑和復(fù)合酶的中心組成部分,但作用濃度較低[25]。Mn2+是乳酸脫氫酶的組成部分,也是某些磷酸轉(zhuǎn)移酶的輔因子,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速度和生物量濃度具有重要的有益影響,可促進(jìn)乳酸生成[26]。Guo Yuxing等[27]研究發(fā)現(xiàn)Mn2+、Mg2+和Ca2+可以顯著增強(qiáng)乳酸菌蛋白酶活力,而Co2+、Zn2+、Ni2+和EDTA則會(huì)抑制該酶活性;與本研究結(jié)果一致,但對(duì)提高乳酸鈣產(chǎn)量的效果不顯著。
2.5.1 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析
以發(fā)酵時(shí)間、初始pH值和接種量為試驗(yàn)因素,基于Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),以乳酸鈣產(chǎn)量為響應(yīng)值,進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸方程擬合及分析。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。
對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸,得二次多元回歸方程:Y=20.47-1.09A+1.48B-0.42C+1.68AB-0.051AC-2.56BC+6.07A2+5.03B2+6.35C2。
為進(jìn)一步分析回歸方程的擬合度,對(duì)模型進(jìn)行ANOVA方差分析,結(jié)果如表3所示。擬合方程的P值小于0.000 1,表明響應(yīng)回歸模型達(dá)到了極顯著水平。失擬項(xiàng)P=0.051 0>0.05,失擬不顯著,說(shuō)明方程的擬合程度較好,回歸方程可以準(zhǔn)確分析和預(yù)測(cè)各因素與乳酸鈣產(chǎn)量之間的關(guān)系。模型的確定系數(shù)R2為0.988 3,說(shuō)明該模型能解釋98.83%響應(yīng)值的變化,因而該模型擬合程度較好,能很好地反映響應(yīng)值的變化,可以利用此模型對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。
表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design with results for response surface analysis
表3 回歸模型和方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model
由回歸模型和方差分析可知,方程一次項(xiàng)B,交互項(xiàng)BC和二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量的影響達(dá)到極顯著水平;方程一次項(xiàng)A、交互項(xiàng)AB影響達(dá)到顯著水平。根據(jù)F值可知,各因素對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量影響的大小順序?yàn)椋撼跏紁H值(B)>發(fā)酵時(shí)間(A)>接種量(C)。
2.5.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化
根據(jù)回歸擬合方程,每2 個(gè)因素對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量作響應(yīng)面和二維等高線圖(圖5)。通過(guò)觀察響應(yīng)面的變化情況和等高線的稀疏程度可直觀地反映因素之間交互作用對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量的影響,當(dāng)圖形呈橢圓形或馬鞍形時(shí),表示兩因素交互作用顯著[28]。分析可知,發(fā)酵液pH值(B)和接種量(C)的交互作用對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量的影響最為明顯。初始pH值對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量影響的等高線較密集,說(shuō)明發(fā)酵液初始pH值的影響更為顯著,與模型方差分析得出的結(jié)論一致。
圖5 各因素交互作用對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量的影響Fig. 5 Interactive effects of variables on calcium lactate yield
2.5.3 最佳條件的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證
通過(guò)回歸模型的預(yù)測(cè),響應(yīng)值(Y)最大值時(shí)各因子水平為A=1、B=1、C=-1。對(duì)應(yīng)的復(fù)合乳酸菌發(fā)酵蛋殼制備乳酸鈣最佳工藝條件為發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間72 h、發(fā)酵液pH 6.5、復(fù)合菌接種量8.0%,在此條件下預(yù)測(cè)乳酸鈣產(chǎn)量為42.030 g/L。為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性,依據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到的發(fā)酵條件,3 次平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,在此條件下,乳酸鈣產(chǎn)量達(dá)(40.01±0.035)g/L,高于陳文潔等[17]報(bào)道的27.28 g/L,與模型預(yù)測(cè)值相差4.8%,與理論值基本相符,說(shuō)明采用此模型優(yōu)化得到的參數(shù)準(zhǔn)確可靠。測(cè)得所制備的乳酸鈣純度為92.65%,高于李逢振等[29]報(bào)道的86.92%。
2.6.1 傅里葉變換紅外光譜
圖6 蛋殼源乳酸鈣產(chǎn)品(A)及其紅外光譜圖(B)Fig. 6 Visual appearance (A) and infrared spectrum (B) of calcium lactate from eggshell
如圖6所示,蛋殼源乳酸鈣呈白色或乳白色晶體粉末;與蛋殼粉的紅外光譜對(duì)比可知,蛋殼鈣經(jīng)發(fā)酵已轉(zhuǎn)化為乳酸鈣。在3 500~3 200 cm-1出現(xiàn)了一個(gè)較寬且強(qiáng)的吸收峰,為游離O—H的彎曲振動(dòng);濃度較高的乳酸鈣試樣中,羥基化學(xué)物產(chǎn)生締合現(xiàn)象,O—H的伸縮振動(dòng)吸收峰稍微向低波數(shù)方向位移所形成的,峰尖約在3 350 cm-1左右。在3 000~2 800 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)一個(gè)小而尖的峰,這是典型的—CH3、C—H伸縮振動(dòng)導(dǎo)致的吸收峰。而本應(yīng)在1 900~1 650 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)的C=O伸縮振動(dòng)的吸收峰由于結(jié)合了Ca2+,向低波數(shù)1 600~1 500 cm-1范圍內(nèi)發(fā)生了偏移。在1 350~1 450 cm-1出現(xiàn)的細(xì)尖峰為C—H的彎曲振動(dòng);紅外光譜在1 300~4 000 cm-1為官能團(tuán)區(qū),小于1 300 cm-1為非官能團(tuán)區(qū),反映的是分子結(jié)構(gòu)變化,如C—C的伸縮振動(dòng)[30]。通過(guò)對(duì)產(chǎn)物乳酸鈣的紅外光譜分析,證實(shí)復(fù)合乳酸菌發(fā)酵蛋殼鈣制備所得產(chǎn)物為乳酸鈣。
2.6.2 X射線衍射
圖7 蛋殼乳酸鈣X-射線衍射Fig. 7 X-ray diffraction patterns of calcium lactate from eggshell
如圖7所示,蛋殼乳酸鈣的衍射峰尖銳清晰,說(shuō)明乳酸鈣結(jié)晶程度較高[31]。將樣品的X-射線衍射圖譜與JCPDS標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)卡片05-0101中不同角度位置(2θ)的乳酸鈣數(shù)據(jù)對(duì)比進(jìn)行物相鑒定[32],發(fā)現(xiàn)在乳酸鈣主要特征衍射峰位置(2θ為8.0°、22.1°、27.4°、45.2°等)左右均出峰,特征峰位置和標(biāo)準(zhǔn)譜圖在相同角度兩圖譜出現(xiàn)衍射峰相似,說(shuō)明晶體及空間結(jié)構(gòu)相似,再次驗(yàn)證發(fā)酵產(chǎn)物為乳酸鈣[33]。
利用雞蛋殼為天然綠色鈣源通過(guò)生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化制備乳酸鈣,采用復(fù)合乳酸菌發(fā)酵蛋殼制備乳酸鈣,單因素試驗(yàn)研究了發(fā)酵溫度、初始pH值、接種量等因素對(duì)乳酸鈣產(chǎn)量的影響;在此基礎(chǔ)上根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,復(fù)合乳酸菌發(fā)酵蛋殼制備乳酸鈣的最佳工藝條件為:發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間72 h、初始pH 6.5、復(fù)合菌接種量8.0%,在此條件下,乳酸鈣產(chǎn)量達(dá)(40.01±0.035)g/L,純度為92.65%。通過(guò)傅里葉變換紅外光譜、X-射線衍射表征了乳酸鈣的結(jié)構(gòu),證實(shí)發(fā)酵得到的產(chǎn)物即為乳酸鈣。此研究為進(jìn)一步利用微生物發(fā)酵蛋殼制備乳酸鈣的開發(fā)利用提供了理論依據(jù),且為雞蛋殼的綜合利用開辟了可行、有效途徑。