劉 剛，梁 琪*，宋雪梅，張 炎

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070）

乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）是乳酸菌生長和代謝過程中產(chǎn)生到外界環(huán)境中的復(fù)雜長鏈、高分子聚合物，是莢膜多糖或細(xì)胞壁外分泌的黏液多糖的總稱[1]。研究表明，EPS具備功能方面的多種特性，在生理上，EPS表現(xiàn)出良好的抗氧化活性、增強(qiáng)免疫、抗氧化、抗腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生等；在物化特性上，EPS是一種安全無毒的增稠劑、穩(wěn)定劑和黏性發(fā)酵劑應(yīng)用于乳品行業(yè)[2]；在酸奶中，EPS可以改善酸乳的質(zhì)地和口感，使酸乳的持水力提高[3]。

全球每年7萬 t多糖用于食品領(lǐng)域中作為增稠劑和穩(wěn)定劑。乳酸菌EPS有廣闊的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，但由于其EPS產(chǎn)量低，乳酸菌菌株穩(wěn)定性差，因而在工業(yè)生產(chǎn)中規(guī)模性應(yīng)用受到限制[4]，因此，乳酸菌EPS產(chǎn)量的提高是目前急需解決的難題。要想解決這一難題，就必須篩選高產(chǎn)菌株及其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。微生物EPS不僅受到自身菌落的影響，而且受到溫度、壓力和光照強(qiáng)度等生長環(huán)境的顯著影響，其培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分的不同，不僅造成乳酸菌EPS產(chǎn)量有影響，甚至?xí)绊懫浣Y(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)。目前乳酸菌EPS研究中，優(yōu)化后乳酸菌菌株EPS產(chǎn)率在17.8%～28.75%有不同程度的提高[5]。因此，通過優(yōu)化發(fā)酵工藝可有效提高菌株EPS產(chǎn)量。此外，響應(yīng)面分析法已廣泛應(yīng)用于許多生物技術(shù)過程，如培養(yǎng)條件和一些生物物質(zhì)生產(chǎn)的優(yōu)化[6]，它克服了傳統(tǒng)方法的不足，在培養(yǎng)條件和工藝參數(shù)方面取得了良好的優(yōu)化效果[7]。

本實(shí)驗(yàn)以甘肅藏區(qū)牦牛乳中篩選得到的嗜熱鏈球菌Q4[8]為野生菌株，誘變后得到的突變株Q4F8為優(yōu)化菌株，以EPS含量為響應(yīng)值，優(yōu)化培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基組成，旨在進(jìn)一步提高EPS的產(chǎn)量，為乳酸菌菌類多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）Q4由甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室分離純化并于-80 ℃超低溫冰箱冷凍保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

GM17培養(yǎng)基：多聚蛋白胨5 g，植物蛋白胨5 g，酵母膏2.5 g，牛肉膏5 g，乳糖5 g，抗壞血酸鈉0.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，磷酸二氫鉀5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 6.9±0.2，于121 ℃高溫滅菌20 min。

脫脂乳培養(yǎng)基：12%的脫脂乳，于115 ℃滅菌15 min。

1.1.3 試劑

葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、魚蛋白胨、Na2HPO4、NaH2PO4、硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）、Na2S2O3、98%無水乙醇、濃硫酸、氯化鈉、三氯乙酸、苯酚等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

723型可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；PHS-3C pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；YX280型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺蘇州凈化設(shè)備有限公司；紫外燈 南京華強(qiáng)電子有限公司；LVDV-1數(shù)字旋轉(zhuǎn)黏度計(jì) 上海方瑞儀器有限公司；TGL-20M臺式高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；85-2控溫磁力攪拌器 金壇市恒豐儀器廠；DW-86L386立式超低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GZX-GF101-2-BS-II電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；NRY-200恒溫?fù)u床 上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化與菌懸液制備[9]

取實(shí)驗(yàn)室甘油管中凍藏的嗜熱鏈球菌菌株Q4解凍，脫脂乳中培養(yǎng)3 次。將活化后的菌2 環(huán)接種于裝有GM17液體培養(yǎng)基30 mL的250 mL三角瓶中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，形成種子液。按3%種子液轉(zhuǎn)接到另一瓶GM17液體培養(yǎng)基中，相同條件下，培養(yǎng)至對數(shù)生長期的培養(yǎng)液，取出菌液4 000 r/min、4 ℃冷凍離心15 min。收集菌體并用0.85%無菌生理鹽水洗滌，最后將菌體懸浮于無菌生理鹽水中且調(diào)整細(xì)胞濃度為108CFU/mL作為待處理細(xì)菌懸浮液，于4 ℃冰箱保藏備用。

1.3.2 菌株EPS含量測定

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照薩如拉等[10]的方法并稍作修改。已有研究證實(shí)，在加熱條件下采用酸-乙醇沉淀的方法，多糖提取率可以提高60%[11]。多糖在濃硫酸的作用下先水解為單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物，通過比色法測定糖含量，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=0.009 1x-0.001，R2=0.998 1。

參照文獻(xiàn)[12-13]的方法并稍作修改。將10 mL GM17發(fā)酵液（發(fā)酵30 h）在95 ℃水浴鍋中加熱10 min，以此達(dá)到去酶活性的目的；待冷卻后置于冷凍離心機(jī)中4 ℃、8 000 r/min離心。15 min后收集上清液并加入5 mL 12% TCA溶液，封口膜封口，放在160 r/min搖床上反應(yīng)1 h并且讓其靜置30 min。再次4 ℃、8 000 r/min冷凍離心15min后收集上清液，將3 倍體積的無水乙醇加入到上清液中，封存于4 ℃冰箱隔夜沉淀（24 h）；取沉淀4 ℃、8 000 r/min冷凍離心15 min，然后沉淀用去離子水溶解沉淀物，與去離子水中透析3 d，每4 h換水一次，冷凍干燥得粗多糖。EPS含量的測定采用硫酸-苯酚法[14]。

1.3.3 菌株的誘變篩選[15]

采用改裝的超凈工作臺進(jìn)行紫外和DES的復(fù)合誘變，篩選出遺傳性能穩(wěn)定的EPS高產(chǎn)誘變菌株。最佳紫外誘變條件為：誘變距離25 cm，誘變時(shí)間150 s；最佳DES誘變條件為：DES體積分?jǐn)?shù)1.0%，誘變溫度36 ℃，誘變時(shí)間26 min。

1.3.4 菌株特性分析

為得到活力優(yōu)良的菌株，需要將菌株的生長情況、OD值等進(jìn)行測定，將誘變前和誘變后活化的菌株，按3%的比例接種于GM17培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)，每2 h取樣，測定菌液的pH值、OD600nm、活菌數(shù)，連續(xù)測定至24 h，以時(shí)間和生長特性作圖繪制嗜熱鏈球菌的生長曲線。

1.3.5 培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)

在GM17液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，選擇不同的碳源和氮源，其他選擇的培養(yǎng)條件為選擇連續(xù)活化3 代的菌株、接種量3%、培養(yǎng)溫度37 ℃、初始pH 6.9和培養(yǎng)時(shí)間30 h，并測定EPS含量，以EPS為指標(biāo)確定該嗜熱鏈球菌產(chǎn)EPS的最佳培養(yǎng)條件。

分別選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的4 種碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖）、0.5%的3 種氮源（胰蛋白胨、大豆蛋白胨、魚蛋白胨）、3 個(gè)碳氮比（乳糖-魚蛋白胨-胰蛋白胨1∶1∶1、1∶2∶2、2∶1∶1）、5 個(gè)碳源質(zhì)量分?jǐn)?shù)（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）和5 個(gè)pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）做對比試驗(yàn)，以EPS含量為指標(biāo)確定最佳碳源、最佳氮源、最佳碳氮比和最佳碳源質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.6 培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)

在GM17培養(yǎng)基中，不同的培養(yǎng)條件下采用硫酸苯酚法測定菌體產(chǎn)生的EPS含量，確定該嗜熱鏈球菌產(chǎn)EPS的最佳培養(yǎng)條件。

分別選擇5 個(gè)接種量水平（1%、2%、3%、4%和5%）、5 個(gè)培養(yǎng)溫度水平（27、32、37、42 ℃和47 ℃）、5 個(gè)培養(yǎng)時(shí)間水平（20、24、28、32 h和36 h）做對比試驗(yàn)，以EPS含量為指標(biāo)確定最佳接種量、最佳培養(yǎng)溫度和最佳培養(yǎng)時(shí)間。

1.3.7 Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X1）、pH值（X2）、接種量（X3）、培養(yǎng)溫度（X4）和培養(yǎng)時(shí)間（X5）5 個(gè)因素的水平值，以EPS產(chǎn)量為響應(yīng)值進(jìn)行2水平的PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理，確定顯著性影響因素。PB試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels used for Plackett-Burman design

1.3.8 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，選取乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、初始pH值和培養(yǎng)溫度為影響EPS含量的3 個(gè)主要因素，以EPS產(chǎn)量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken的設(shè)計(jì)原理[16]，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)。Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3.9 EPS抑菌性實(shí)驗(yàn)

制備雙層瓊脂平板，分別涂布大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，采用牛津杯打孔法打孔，取真空冷凍干燥的EPS溶解于蒸餾水中，加入預(yù)先制備好的孔徑中，于4 ℃擴(kuò)散4 h，置于37 ℃培養(yǎng)，測量抑菌圈直徑。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本研究涉及的數(shù)據(jù)除葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線外，均重復(fù)3 次。采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行PB試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理，用Origin 8.0軟件進(jìn)行繪圖處理，SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用ANOVA，并選用Duncan多重比較進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合誘變選育高產(chǎn)EPS菌株

圖1 復(fù)合誘變菌株選育Fig. 1 Exopolysaccharide yields of the original and mutant strains

對實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株Q4在最佳條件下進(jìn)行先化學(xué)（DES）后紫外的復(fù)合誘變，經(jīng)過菌落特征和黏度的初篩（篩選菌落直徑大、邊緣整齊、顯微鏡觀察為鏈球狀的菌落），EPS的復(fù)篩以及菌株的穩(wěn)定性分析，篩選出1 株穩(wěn)定性良好的高產(chǎn)EPS嗜熱鏈球菌菌株Q4F8，突變株比原始菌株產(chǎn)量提高80.95%（圖1）。

2.2 菌株的生長特性分析

圖2 嗜熱鏈球菌的生長曲線Fig. 2 Growth curves of Streptococcus thermophiles Q4 and Q4F8

由圖2可以看出，經(jīng)誘變后菌株比初始菌株對數(shù)期提前，且達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)誘變菌株比原始菌株菌體濃度和OD值均有所提高，說明發(fā)酵活力和生物量都有不同程度的提高。突變株更有利于吸收外界環(huán)境營養(yǎng)，能更好地繁殖和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。

2.3 培養(yǎng)基成分對嗜熱鏈球菌Q4F8產(chǎn)EPS的影響

2.3.1 碳源種類對EPS的影響

圖3 碳源對Q4F8菌株EPS產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effect of carbon sources on EPS yield of Q4F8

除菌株自身遺傳因素外，其培養(yǎng)基組成（碳源、氮源）也會對乳酸菌EPS產(chǎn)量造成很大影響[17]。因此，可通過優(yōu)化EPS的合成條件提高菌株產(chǎn)EPS能力。由圖3可知，嗜熱鏈球菌Q4F8可利用多種碳源合成EPS。其中半乳糖作為碳源時(shí)，EPS產(chǎn)量最少，為98.68 mg/L，并且和其他碳源相比存在顯著差異（P＜0.05）。當(dāng)碳源為乳糖時(shí)，Q4F8 EPS產(chǎn)量最高，達(dá)到154.21 mg/L（P＜0.05）。說明嗜熱鏈球菌Q4F8利用可分解乳糖，利用乳糖能力強(qiáng)，這與Cheirsilp[18]和Desaia[19]等的研究一致，以乳糖為碳源時(shí)，EPS產(chǎn)量最高。

2.3.2 氮源種類對EPS的影響

圖4 氮源對Q4F8菌株EPS產(chǎn)量的影響Fig. 4 Effect of nitrogen sources on EPS yield of Q4F8

乳酸菌合成EPS時(shí)，氮源是必須的營養(yǎng)成分，氮源種類和添加量的不同都會對菌株分泌EPS造成不同影響[20-21]。由圖4可以看出，多種氮源對菌株的發(fā)酵產(chǎn)糖有不同影響。當(dāng)?shù)礊轸~蛋白胨時(shí)，該菌株合成EPS最大，其次為胰蛋白胨，最后是大豆蛋白胨，3 種氮源對菌株Q4F8合成EPS具有顯著性差異（P＜0.05），說明嗜熱鏈球菌Q4F8利用動物蛋白胨作氮源的能力優(yōu)于植物蛋白胨。氮源通過影響乳酸菌的生長，使菌體的密度增加，從而影響EPS的產(chǎn)量[22]。

2.3.3 碳氮比對EPS的影響

圖5 碳氮比對Q4F8菌株EPS產(chǎn)量的影響Fig. 5 Effects of carbon to nitrogen ratio on EPS yield of Q4F8

碳氮比對菌株的生長和代謝有直接影響，碳氮比相對低時(shí)，有利于菌體生長，相反，碳氮比相對較高時(shí)則變化不顯著，但當(dāng)碳氮比過高時(shí)，相當(dāng)于滲透壓升高，影響了菌體的生長代謝功能[23]。由圖5可以看出，不同碳氮比對菌株Q4F8合成EPS存在顯著性差異（P＜0.05）。而當(dāng)碳氮比在1∶2∶2和2∶1∶1時(shí)，其無差異顯著性（P＞0.05）?？紤]到EPS產(chǎn)量的差別，碳氮比在2∶1∶1的條件下其EPS要高于1∶2∶2，其次從原料的經(jīng)濟(jì)基礎(chǔ)上考慮。因此，選擇碳氮比2∶1∶1為最佳碳氮比進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.3.4 碳源（乳糖）質(zhì)量分?jǐn)?shù)對EPS的影響

圖6 乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對Q4F8菌株EPS產(chǎn)量的影響Fig. 6 Effect of lactose concentration on EPS yield of Q4F8

碳源是乳酸菌菌株細(xì)胞生長及其重要的能量來源，對EPS產(chǎn)量有很大影響[24]，碳源影響EPS合成相關(guān)的酶從而對EPS的合成造成影響。如圖6所示，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乳糖對菌株Q4F8合成EPS的影響存在顯著性差異（P＜0.05）。乳糖溶液在1.0%～1.5%范圍內(nèi)，菌株合成EPS的能力呈上升趨勢，其中1.5%時(shí)EPS最高。乳酸菌菌體細(xì)胞中含有碳源的反饋抑制體系[25]，當(dāng)乳糖高于1.5%時(shí)，其EPS產(chǎn)量呈現(xiàn)下降趨勢，表現(xiàn)出高濃度抑制EPS合成的現(xiàn)象。

2.4 發(fā)酵條件對嗜熱鏈球菌Q4F8產(chǎn)EPS的影響

2.4.1 初始pH值對菌株Q4F8產(chǎn)EPS的影響

圖7 pH值對Q4F8菌株EPS產(chǎn)量的影響Fig. 7 Effect of pH value on EPS yield of Q4F8

不同的乳酸菌其生長特性與合成EPS都有最適的pH值范圍。pH值對菌體的代謝影響主要是通過影響細(xì)胞膜功能和營養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度影響代謝[23]。由圖7可以看出，pH值太高或太低都不利于其EPS的合成，在pH 5.5～6.5時(shí)變化差異顯著（P＜0.05），菌株Q4F8合成EPS在pH 6.5時(shí)達(dá)到最大值，初始pH值大于6.5時(shí)，其EPS產(chǎn)量降低水平不明顯（P＜0.05）。說明菌株Q4F8在中性環(huán)境下，更有利于其代謝產(chǎn)物的積累，其最適pH值為6.5。

2.4.2 接種量對菌株Q4F8產(chǎn)EPS的影響

由圖8可知，當(dāng)接種量在1%～4%時(shí)，由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)豐富，伴隨著接種量的增加，菌株合成EPS的能力也在增加。當(dāng)接種量超過4%時(shí)，菌株合成EPS的能力呈下降趨勢，在營養(yǎng)成分一定時(shí)，接入過多菌種，其營養(yǎng)物質(zhì)加速消耗，用于合成EPS的能力不足，導(dǎo)致EPS產(chǎn)量下降，與Raza等[26]報(bào)道的結(jié)果一致。當(dāng)接種量為3%時(shí)，EPS產(chǎn)量最高。

圖8 接種量對Q4F8菌株EPS產(chǎn)量的影響Fig. 8 Effects of inoculum amount on EPS yield of Q4F8

2.4.3 培養(yǎng)溫度對菌株Q4F8產(chǎn)EPS的影響

圖9 培養(yǎng)溫度對Q4F8菌株EPS產(chǎn)量的影響Fig. 9 Effects of fermentation temperature on EPS yield of Q4F8

由圖9可以看出，培養(yǎng)溫度對嗜熱鏈球菌Q4F8合成EPS的影響差異顯著（P＜0.05）。隨著溫度的升高，合成EPS產(chǎn)量增加，當(dāng)溫度為42 ℃時(shí)，EPS產(chǎn)量最大，隨后隨著溫度的升高，EPS產(chǎn)量呈下降趨勢。說明低溫和高溫環(huán)境都會抑制乳酸菌EPS的合成，低溫時(shí)菌體生長緩慢，數(shù)量不足，進(jìn)而影響其合成，高溫時(shí)可能導(dǎo)致合成EPS的酶活性下降。因此，本試驗(yàn)選擇42 ℃為最佳培養(yǎng)溫度。

2.4.4 培養(yǎng)時(shí)間對菌株Q4F8產(chǎn)EPS的影響

圖10 培養(yǎng)時(shí)間對Q4F8菌株EPS產(chǎn)量的影響Fig. 10 Effect of fermentation time on EPS yield of Q4F8

如圖10所示，隨著時(shí)間的延長，EPS產(chǎn)量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，下降可能是由于酶解條件或者營養(yǎng)環(huán)境惡化等參數(shù)的改變所致[27]。隨著時(shí)間的延長合成EPS產(chǎn)量呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05），Q4F8在培養(yǎng)28 h時(shí)，其EPS產(chǎn)量達(dá)到最大值。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌體出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，分解出代謝多糖的酶，進(jìn)而降低EPS產(chǎn)量。

2.5 PB試驗(yàn)結(jié)果

表3 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Plackett-Burman design with experimental results

PB試驗(yàn)根據(jù)2水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過比較2水平因素的差異性和整體的差異性確定因素之間的顯著性，篩選因素達(dá)到節(jié)約試驗(yàn)耗材、提高試驗(yàn)響應(yīng)值的目的[28]。PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值見表3。利用Design-Expert 8.0.6軟件對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，由表4可知，模型F值為55.41，表明該模式具有重要意義，R2=0.978 8，說明存在97.88%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可用該模型解釋。對合成EPS影響極顯著（P＜0.01）的因素依次為X1＞X2＞X4＞X3，X5對合成EPS影響顯著（P＜0.05）。因此，選取乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值和培養(yǎng)溫度3 個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)。

表4 PB試驗(yàn)方差分析Table 4 Analysis of variance of experimental results from Plackett-Burman design

2.6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平及響應(yīng)值見表5，對其數(shù)據(jù)進(jìn)行處理的方差分析見表6。該模型差異極顯著（P＜0.01）。模型的失擬項(xiàng)無顯著性差異（P=0.216 6＞0.05），說明所選的模型擬合程度好，可較好地?cái)M合試驗(yàn)結(jié)果。確定系數(shù)R2為0.995 4，和調(diào)整確定系數(shù)R2Adj為0.989 4基本接近，表明模型的回歸方程和相關(guān)性都很好。因此，Box-Behnken設(shè)計(jì)是可靠的，該模型可較好地應(yīng)用于嗜熱鏈球菌合成EPS的理論預(yù)測。模型一次項(xiàng)X1對響應(yīng)值EPS產(chǎn)量影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05），一次項(xiàng)X2、X3對響應(yīng)值EPS產(chǎn)量影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；交互項(xiàng)X1X2、X1X3對響應(yīng)值EPS產(chǎn)量影響不顯著（P＞0.05），X2X3對響應(yīng)值EPS產(chǎn)量影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；平方項(xiàng)X12、X22、X32對響應(yīng)值EPS產(chǎn)量影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；3 個(gè)因素對合成EPS的影響大小依次為：X2＞X3＞X1，表明，3 個(gè)因素并不是簡單的線性關(guān)系。經(jīng)修正不顯著項(xiàng)后，多元回歸擬合模型的二次多項(xiàng)式方程為：

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Box-Behnken design with experimental results

表6 Box-Behnken試驗(yàn)方差分析Table 6 Analysis of variance of experimental results from Box-Behnken design

2.7 各因素之間響應(yīng)面交互作用分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面圖繪制，通過響應(yīng)面可直觀地分析各因素及因素相互之間的交互作用對響應(yīng)值的影響[29]。各因素之間響應(yīng)面3D圖和等高線圖能直觀反映出其相互作用的強(qiáng)弱，橢圓形的等高線表示兩因素之間的交互作用存在顯著性差異，圓形則表示兩因素之間交互作用無顯著性差異[30-31]。

圖11 各因素交互作用對EPS產(chǎn)量影響的等高線和響應(yīng)面圖Fig. 11 Contour and response surface plots showing the interactive effects of various factors on EPS production

圖11 a可以看出，當(dāng)培養(yǎng)溫度控制在0水平時(shí)，乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH值的等高線近似圓形，表明乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH值的交互作用對EPS的合成影響不顯著；固定乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為一定值，EPS隨著pH值的升高變化不明顯，表明乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH值的交互作用對EPS的合成影響不顯著；隨著乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，EPS產(chǎn)量先增加后減小，乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.40%～1.60%之間，EPS產(chǎn)量最大。

圖11b可以看出，固定pH值制在0水平時(shí)，乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和培養(yǎng)溫度的等高線近似圓形，表明乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和培養(yǎng)溫度的交互作用對EPS的合成影響不顯著；乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定時(shí)，隨著培養(yǎng)溫度的升高，EPS產(chǎn)量呈現(xiàn)先增后減小的趨勢，培養(yǎng)溫度在39～40 ℃之間，EPS產(chǎn)量最大。

圖11c可以看出，乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0水平時(shí)，培養(yǎng)溫度和pH值的等高線為橢圓形，表明培養(yǎng)溫度和pH值的交互作用對EPS的合成影響達(dá)到顯著水平；固定培養(yǎng)溫度為一定值，其隨著pH值的升高，其EPS呈現(xiàn)增加的趨勢。

2.8 發(fā)酵條件的優(yōu)化及驗(yàn)證結(jié)果

對回歸模型進(jìn)行優(yōu)化分析，獲得嗜熱鏈球菌Q4F8合成EPS的最佳工藝條件為pH 6.90、培養(yǎng)溫度為42 ℃、乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.51%，并且在此條件下EPS產(chǎn)量的理論預(yù)測值為189.98 mg/L。在最優(yōu)條件下進(jìn)行3 次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，獲得的EPS產(chǎn)量為191.47 mg/L，與響應(yīng)面優(yōu)化預(yù)測的結(jié)果基本一致，響應(yīng)面分析方法得到的嗜熱鏈球菌合成EPS的工藝條件真實(shí)，在一定程度上具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.9 EPS抑菌性分析

表7 EPS抑菌性實(shí)驗(yàn)Table 7 Antimicrobial activity of the EPS produced by Q4F8

從表7得出，突變株具有較好的抑制食品中常見的三大致致病菌滋生的效果，其中突變株產(chǎn)生的EPS對大腸桿菌抑菌效果最好到達(dá)（14.209±0.853）mm。從而在生產(chǎn)中以提高發(fā)酵乳制品的貨架期和益生性能有明顯的效果。

3 結(jié) 論

突變株有效提高了自身的生長性能，對環(huán)境的適應(yīng)能力更強(qiáng)，更有利于自身菌體的生長及次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，尤其是EPS的產(chǎn)生。本研究從碳源和氮源種類、碳源質(zhì)量濃度、碳氮比、接種量、pH值、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間對EPS影響的單因素基礎(chǔ)上，聯(lián)和采用PB試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)的方法，建立了嗜熱鏈球菌Q4F8發(fā)酵EPS條件的多項(xiàng)式模型，經(jīng)顯著性檢驗(yàn)分析和響應(yīng)面分析，其最佳工藝參數(shù)為pH 6.90、培養(yǎng)溫度42 ℃和乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.51%，獲得的理論值為189.98 mg/L。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)際值為191.47 mg/L，證明該模型準(zhǔn)確可靠。該研究為今后對此菌株EPS結(jié)構(gòu)、生理功能和機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為嗜熱鏈球菌Q4F8產(chǎn)EPS的工業(yè)化制備和應(yīng)用提供理論參考。突變株產(chǎn)生的EPS能有效抑制食品中常見的三大致病菌滋生，可更好地用于發(fā)酵工業(yè)及其食品產(chǎn)業(yè)中，以提高發(fā)酵產(chǎn)品的貨架期和益生性能，為今后在功能性乳酸菌發(fā)酵劑的研究及其產(chǎn)品的貯藏性方面提供進(jìn)一步的研究基礎(chǔ)。