何賀賀，林厚民，寇力丹，覃鳳蘭，韋宇拓，黃日波，杜麗琴*

（亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005）

蔗糖在植物體內(nèi)廣泛存在，是人類生產(chǎn)生活中最重要的食品添加劑之一[1]。利用生物酶資源拓寬蔗糖的應(yīng)用范圍，生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品成為研究熱點(diǎn)方向之一。蔗糖磷酸化酶（EC 2.4.1.7）在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)屬于糖基水解酶13家族[2]。此酶能夠可逆催化蔗糖和無機(jī)磷酸生成D-果糖和葡萄糖-1-磷酸[3]，葡萄糖-1-磷酸是糖酵解途徑的重要中間體[4]，這使得蔗糖磷酸化酶在代謝中具有重要作用。蔗糖磷酸化酶除能水解蔗糖以外，還具有催化轉(zhuǎn)移葡萄糖苷鍵的能力[5]，并且受體較為廣泛，包括無機(jī)磷酸、水，及含有酚羥基、醇羥基及羧基的物質(zhì)[6]。葡萄糖基具有極性強(qiáng)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的特點(diǎn)，因此所生成的產(chǎn)物在理化性質(zhì)如耐熱性、水溶性、抗氧化性等方面都普遍得到改善，使得該酶在食品、醫(yī)藥、及化妝品等行業(yè)具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值和潛力[7]。目前此酶研究最多的是催化轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)，并且對(duì)其分子改造大多也是為了改善轉(zhuǎn)糖苷性質(zhì)。其中糖類底物的轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物益生元低聚糖，常被作為低熱量、非齲齒性的食品添加劑，也是目前研究熱點(diǎn)之一[8]。

蔗糖磷酸化酶主要存在于微生物體內(nèi)，最早于20世紀(jì)40年代分別被Kagan[9]與Doudoroff[10]等從腸膜明串珠菌和嗜糖假單胞菌中發(fā)現(xiàn)。Schwarz等[11]通過對(duì)腸膜明串珠菌的蔗糖磷酸化酶進(jìn)行突變改造，確定了196位點(diǎn)的天冬氨酸為其轉(zhuǎn)糖苷關(guān)鍵位點(diǎn)之一，揭開了探索該酶催化機(jī)理的序幕。Van Den Broek等[12]克隆表達(dá)了來自青春雙歧桿菌DSM 20083的蔗糖磷酸化酶，并研究轉(zhuǎn)糖苷性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)于單糖具有良好的轉(zhuǎn)糖苷特性，而二糖和三糖并不適合作為其底物。李恬等[13]以蔗糖作為葡萄糖的供體底物，麥芽四糖作為加成引物，利用蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶協(xié)同作用探索出了直鏈糊精的低成本且操作簡(jiǎn)單的合成途徑，為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)。

為改善酶學(xué)性質(zhì)，對(duì)蔗糖磷酸化酶的分子改造也取得了較多進(jìn)展。Verhaeghe等[14]利用半理性突變的方法，構(gòu)建突變體文庫(kù)并進(jìn)行高通量篩選，得到了一個(gè)對(duì)曲二糖選擇性高達(dá)95%的雙位點(diǎn)突變體，為其在食品及益生元領(lǐng)域的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。Kraus等[15]首次對(duì)于活性位點(diǎn)進(jìn)行突變，間接性的增大活性口袋空間，使得該酶能對(duì)以多酚類的底物具有轉(zhuǎn)糖苷作用。其中對(duì)于槲皮素的糖基化能提高其抗氧化還原能力[16]，并且人體對(duì)于其吸收利用能力也得到增強(qiáng)[17]。

綜上，對(duì)于蔗糖磷酸化酶的研究必定是以大量酶學(xué)性質(zhì)數(shù)據(jù)作為基礎(chǔ)和支撐的。本研究旨在豐富不同來源蔗糖磷酸化酶的數(shù)據(jù)，對(duì)蔗糖磷酸化酶進(jìn)行改造，進(jìn)一步挖掘潛在的結(jié)構(gòu)和理論價(jià)值，得到更多有關(guān)于分子改造的經(jīng)驗(yàn)，為此酶分子改造技術(shù)的進(jìn)步以及在食品行業(yè)的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腸膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroidesATCC12291、大腸桿菌Escherichia coliM15/pREP4、大腸桿菌E. coliXL10-Gold均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

高保真DNA聚合酶Prime STARTMHS、dNTP Mixture、λDNA/Hind III Marker、蛋白質(zhì)Marker以及限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hind III、BamH I、T4DNA連接酶等大連TaKaRa寶生物工程有限公司；DpnI 富酶泰斯生物技術(shù)（深圳）有限公司；DNA純化試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒 BioFlux杭州博日科技有限公司；鎳親和層析填料Ni-NTA 德國(guó)Qiagen公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG） 美國(guó)Gibco公司；葡萄糖-1-磷酸 美國(guó)Sigma公司；色譜級(jí)乙腈 美國(guó)Fisher公司；葡萄糖、蔗糖等其他糖類試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Biometra聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國(guó)耶拿公司；SHEL LAB W20M-2水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海予騰生物科技有限公司；恒溫?fù)u床 上海智城分析儀器制造有限公司；臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)艾本德公司；酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器公司；1260 infinity Series高效液相色譜分析儀 美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 腸膜明串珠菌ATCC 12291蔗糖磷酸化酶基因的克隆

將腸膜明串珠菌ATCC 12291活化培養(yǎng)，采用機(jī)械破胞法提取基因組DNA。對(duì)已報(bào)道的腸膜明串珠菌ATCC 12291蔗糖磷酸化酶基因lmsp所編碼的氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽分析，然后設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，引物為：LMsp-F：5’-CGCGGATCCGAAATTCAAAACA AAGCAATGTTG-3’，引入BamH I酶切位點(diǎn)；LMsp-R：5’-CCCAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTTCTGAGT CAAATTATCACT-3’，引入Hind III酶切位點(diǎn)和組氨酸標(biāo)簽。

PCR程序：98 ℃、2 min預(yù)變性，98 ℃、10 s變性，56.5 ℃、15 s退火，72 ℃、2 min延伸，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min。將PCR產(chǎn)物和pQE30質(zhì)粒分別進(jìn)行BamH I和Hind III雙酶切處理，之后經(jīng)連接并轉(zhuǎn)化至E.coliXL10-Gold中。經(jīng)過測(cè)序，將成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pQE-lmsp。

1.3.2 重組酶LMsp的誘導(dǎo)表達(dá)和蛋白質(zhì)純化

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coliM15/pREP4中，于37 ℃培養(yǎng)至OD600nm約0.4～0.6時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，20 ℃、180 r/min培養(yǎng)22 h。離心并收集菌體，超聲波破碎后，對(duì)上清液進(jìn)行Ni-NTI鎳親和層析，純化后得到重組酶命名為L(zhǎng)Msp，并進(jìn)行變性十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。

1.3.3 重組酶LMsp的酶學(xué)性質(zhì)分析

利用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定酶學(xué)的基本參數(shù)[18]。反應(yīng)體系設(shè)為200 μL。取180 μL 0.2 mol/L磷酸氫二鈉-0.1 mol/L檸檬酸緩沖液、10 μL 20 g/100 mL蔗糖，在最適反應(yīng)溫度溫浴2 min后，加入10 μL適當(dāng)稀釋酶液，精確反應(yīng)20 min后加入2 倍體積3,5-二硝基水楊酸（400 μL）終止反應(yīng)，沸水浴5 min顯色。待樣品冷卻至室溫，取200 μL至96 孔酶標(biāo)板中，在540 nm波長(zhǎng)處讀取樣品的吸光度。

蔗糖磷酸化酶活力單位（U）的定義：在最適反應(yīng)條件下，每1 min水解蔗糖釋放1 μmol還原糖所需的酶量。

1.3.3.1 最適pH值的測(cè)定

以pH 4.0～8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制反應(yīng)體系，加入適當(dāng)稀釋純酶液在37 ℃條件下精確反應(yīng)20 min，測(cè)定不同pH值條件下的酶活力。以最高活力為100%，計(jì)算不同pH值條件下酶的相對(duì)活力，相對(duì)活力最高的pH值即為酶最適反應(yīng)pH值。

1.3.3.2 最適溫度的測(cè)定

在最適p H值條件下，測(cè)定在不同反應(yīng)溫度（30～65 ℃）條件下的酶活力，以最高活力為100%計(jì)算不同溫度條件下酶的相對(duì)活力，相對(duì)活力最高的溫度即為酶最適反應(yīng)溫度。

1.3.3.3 重組酶pH值穩(wěn)定性的測(cè)定

將重組酶在不同pH值的緩沖液（4.0～8.0）中于4 ℃保存12 h，在最適反應(yīng)條件下測(cè)定其殘存酶活力，以保存在pH 7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉洗脫液中的酶活力為100%，計(jì)算不同pH值下重組酶的相對(duì)活力。

1.3.3.4 重組酶熱穩(wěn)定性的測(cè)定

將重組酶保存在不同溫度（25～60 ℃）下1 h，立即取出放于冰上，在最適反應(yīng)條件下測(cè)定殘存酶活力，以4 ℃保存的酶活力為100%，計(jì)算不同溫度下重組酶的相對(duì)活力。

1.3.3.5 重組酶Km和Vmax值的測(cè)定

在最適反應(yīng)溫度和pH值條件下，測(cè)定以不同濃度（1.5～234 mmol/L）蔗糖為底物時(shí)的酶活力，帶入經(jīng)典米氏方程得到酶的Km、Vmax值。

1.3.3.6 轉(zhuǎn)糖苷功能的測(cè)定

以15%葡萄糖-1-磷酸（溶于最適pH值的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液）為葡萄糖基供體，5%的D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-木糖醇、D-半乳糖、D-甘露糖、D-甘露糖醇、D-果糖、D-葡萄糖、L-山梨糖、D-山梨糖醇、L-鼠李糖為受體，加入60 μg純化酶液配制成200 μL反應(yīng)體系，在最適條件下反應(yīng)12 h，沸水浴10 min終止反應(yīng)，冷卻至室溫后，12 000 r/min離心30 min取上清液進(jìn)行高效液相色譜分析，檢測(cè)其反應(yīng)產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化率定義為實(shí)驗(yàn)組底物減少量與對(duì)照組底物量的比值。

色譜檢測(cè)條件：檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器（Agilent 1260 RID）、散射蒸發(fā)光檢測(cè)器（Allteach 2000ES ELSD）；色譜柱：Alltima Aminoz NH2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：72%乙腈；流速：1 mL/min；柱溫：室溫（26 ℃）；上樣量：20 μL。

1.3.4 LMsp的分子改造

采用半理性設(shè)計(jì)的方法尋找可能影響蔗糖磷酸化酶LMsp轉(zhuǎn)糖苷活性的關(guān)鍵氨基酸，并利用反向PCR技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)突變改造。

使用建模軟件SWISS-MODEL對(duì)蔗糖磷酸化酶LMsp的氨基酸序列進(jìn)行分析，以青春雙歧桿菌蔗糖磷酸化酶的3D結(jié)構(gòu)（序列一致性＞36%）為模板，建立LMsp的蛋白質(zhì)三維模型。使用PyMOL軟件對(duì)LMsp的蛋白質(zhì)三維模型進(jìn)行分析，并結(jié)合與另外2個(gè)氨基酸序列相差較小，但轉(zhuǎn)糖苷性質(zhì)差異較大的兩個(gè)序列的比對(duì)結(jié)果（分別來自于腸膜明串珠菌NRRL B1149、腸膜明串珠菌NRRL B1355的蔗糖磷酸化酶），找到了3 個(gè)可能影響LMsp轉(zhuǎn)糖苷活性的關(guān)鍵氨基酸殘基，并進(jìn)行突變改造。突變引物如表1所示。

表1 反向PCR引物Table 1 Primer sequences used for inverse-PCR

定點(diǎn)突變PCR程序：除退火溫度為57 ℃外，其他條件同1.3.1節(jié)。PCR產(chǎn)物中加入Dpn I酶消解質(zhì)粒模板，膠回收后將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E. coli XL10-Gold中經(jīng)過測(cè)序獲得正確突變體。并且在單點(diǎn)突變體基礎(chǔ)上，進(jìn)行累積突變，獲得T180A-T219V、T180A-P236S、T219V-P236S和T180A-T219V-P236S四個(gè)聯(lián)合突變體。

蔗糖磷酸化酶LMsp突變體的誘導(dǎo)表達(dá)參照1.3.2節(jié)進(jìn)行；酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定及轉(zhuǎn)糖苷性質(zhì)研究參照1.3.3節(jié)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖磷酸化酶的生物信息學(xué)分析和基因克隆

使用SMART軟件對(duì)腸膜明串珠菌ATCC12291的蔗糖磷酸化酶基因所編碼的氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組件分析。生物信息學(xué)分析與基因克隆結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明其N端30～337位氨基酸為α-淀粉酶結(jié)構(gòu)域，不具有信號(hào)肽。以腸膜明串珠菌ATCC12291的基因組DNA為模板，用引物L(fēng)Msp-F、LMsp-R按照1.3.1節(jié)中方法PCR擴(kuò)增目的基因，得到一條大小約為1.5 kb的特異性條帶，測(cè)序正確后將其命名為lmsp，對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)大小預(yù)計(jì)為55 848.77 Da。

圖1 LMsp蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組件（A）及目的基因的克隆（B）Fig. 1 Modular architecture (A) and cloning (B) of target gene

2.2 重組酶LMsp的誘導(dǎo)表達(dá)和蛋白質(zhì)純化

重組菌誘導(dǎo)后裂解物菌體蛋白的SDS-PAGE分析如圖2所示。含有重組質(zhì)粒的菌株約在56 kDa大小處表達(dá)有明顯的蛋白質(zhì)特征條帶，與理論分子質(zhì)量一致。純化后的重組蛋白LMsp在預(yù)期大小處的條帶明顯且單一，說明目的蛋白符合預(yù)期，即lmsp已在宿主菌內(nèi)成功表達(dá)，可進(jìn)一步測(cè)定酶學(xué)性質(zhì)。

圖2 重組蛋白LMsp的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein LMsp

2.3 重組酶LMsp的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 pH值和溫度對(duì)于重組酶LMsp的影響

如圖3A、B所示，LMsp的最適pH值為6.5，在pH 5.5～7.5之間能保持50%以上的酶活力。最適溫度為40 ℃，在30～45℃之間能保持50%以上的酶活力。

LMsp在pH 4.5～8.0的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液中4 ℃保存24 h后，殘余酶活力在70%以上（圖3C），說明在此范圍內(nèi)LMsp的酸堿穩(wěn)定性較好。在25～40 ℃條件下水浴保溫1 h后，仍殘留有50%以上的酶活力，其中在25～35 ℃時(shí)能穩(wěn)定保留有80%以上的酶活力（圖3D）。

圖3 pH值和溫度對(duì)重組蛋白質(zhì)LMsp酶活力的影響Fig. 3 Effect of pH and temperature on recombinant enzyme activity

2.3.2 LMsp的動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定結(jié)果

利用GraphPad Prism 5軟件對(duì)所測(cè)酶活數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，通過非線性回歸擬合得到動(dòng)力學(xué)常數(shù)（圖4）Km為（34.16±1.219）mmol/L，Vmax值為（370.5±6.049）μmol/（mg·min）。

圖4 LMsp的Km和Vmax值Fig. 4 Km and Vmax values of LMsp

2.3.3 LMsp轉(zhuǎn)糖苷功能分析

在以15%的葡萄糖-1-磷酸為供體，受體為5%的糖類時(shí)，檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物并計(jì)算轉(zhuǎn)化率如表2所示?？芍狶Msp對(duì)D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖醇、D-半乳糖、D-甘露糖、D-果糖、D-葡萄糖、L-山梨糖具有轉(zhuǎn)糖苷活性，尤其對(duì)L-阿拉伯糖具有75%的轉(zhuǎn)化效率。

表2 LMsp轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率Table 2 HPLC analysis of transglycosidase products from LMsp

2.4 LMsp的分子改造

2.4.1 LMsp的同源建模分析與突變位點(diǎn)的選擇

選擇來自與蔗糖磷酸化酶LMsp氨基酸序列一致性大于30%（序列一致性為36.58%）的青春雙歧桿菌3D結(jié)構(gòu)為模板，使用SWISS-MODEL建立了LMsp的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。找出了距離LMsp催化親核試劑196位天冬氨酸10 ?以內(nèi)的氨基酸殘基位點(diǎn)（圖5中的橘黃色棒狀物）。

圖5 距離LMsp催化親核試劑10 ?以內(nèi)的氨基酸殘基Fig. 5 Amino acid residues from the catalytic nucleophile of LMsp within 10 ?

已有研究[19]發(fā)現(xiàn)來自腸膜明串珠菌NRRL B1149和腸膜明串珠菌NRRL B1355的蔗糖磷酸化酶與LMsp有高達(dá)86%以上的氨基酸序列相似性，但轉(zhuǎn)糖苷活性差別較大，因此推測(cè)2 種菌中不同的氨基酸殘基中包含有影響轉(zhuǎn)糖苷活力的關(guān)鍵位點(diǎn)。

結(jié)合LMsp同源建模所找到的距離催化親核試劑10 ?以內(nèi)的氨基酸殘基位點(diǎn)，并根據(jù)序列比對(duì)分析的結(jié)果，找出了3 個(gè)可能影響LMsp轉(zhuǎn)糖苷活性的氨基酸殘基位點(diǎn)，即T180、T219、P236，如圖6所示。將這3 個(gè)位點(diǎn)突變成為腸膜明串珠菌NRRL B1355氨基酸序列上所對(duì)應(yīng)的T180A、T219V、P236S，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行累積突變，直至獲得LMsp在180、219、236三個(gè)位點(diǎn)上的全部7 個(gè)突變體。

圖6 LMsp突變位點(diǎn)的選擇Fig. 6 Selection of mutation site in LMsp

2.4.2 突變體的獲得與突變蛋白的表達(dá)純化

用表1中引物，以pQE-lmsp為模板反向PCR擴(kuò)增得到目的產(chǎn)物，將測(cè)序正確的突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coliM15/pREP4中得到突變體。突變體經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)并使用鎳親和層析純化，純化后的7 個(gè)突變蛋白分子質(zhì)量大小一致，約為56 kDa，與預(yù)期大小相符。SDS-PAGE分析結(jié)果如圖7所示。

圖7 突變蛋白SDS-PAGE分析Fig. 7 SDS-PAGE analysis of purified mutant proteins

2.4.3 突變酶酶學(xué)性質(zhì)

將所得突變體，按照1.3.3節(jié)中的酶活測(cè)定方法，對(duì)比野生酶LMsp結(jié)果如表3所示。突變酶的最適溫度和最適pH值與野生重組酶LMsp相比變化不大，Km、Vmax值較野生酶相比變化明顯。其中T180A的Km值為（77.74±5.671）mmol/L，比野生酶高出（43.58±4.452）mmol/L，提高了約1.28 倍，該突變體對(duì)蔗糖的親和力降低最大。同時(shí)也得到了對(duì)于底物親和力提高的突變體T219V-P236S。突變酶T180A的Vmax值（（618.1±23.37） μmol/（min·mg））比野生酶高出（247.6±17.321）μmol/（min·mg），酶活力顯著上升。而其余各突變酶的Vmax值與野生酶相比均有不同程度的下降，其中P236S、T180A-T219V、T180A-P236S及T219V-P236S的Vmax值與突變前相比下降幅度較明顯，分別約為之前的60%、41%、63%和60%。

表3 突變體酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定結(jié)果Table 3 Enzymatic properties of mutants

2.4.4 突變體轉(zhuǎn)糖苷功能

由表4可知，在以15%的葡萄糖-1-磷酸為供體，受體底物為5%糖類時(shí)，LMsp及其突變體對(duì)L-阿拉伯糖均有很高的轉(zhuǎn)糖苷活性。與野生重組酶相比，突變酶T180A、P236S對(duì)L-山梨糖的轉(zhuǎn)糖苷活性提高了約15%；T180A、P236S、T180A-P236S對(duì)L-阿拉伯糖的轉(zhuǎn)糖苷活性基本不變；T180A、T219V、T180A-T219V對(duì)D-果糖的轉(zhuǎn)糖苷活性基本不變；P236S、T219V-P236S對(duì)D-葡萄糖的轉(zhuǎn)糖苷活性與野生酶基本一致；T180A、T219V-P236S、T180A-T219V-P236S對(duì)D-木糖醇的轉(zhuǎn)糖苷活性基本不變；P236S對(duì)D-甘露糖，T219V對(duì)L-山梨糖的轉(zhuǎn)糖苷活性同野生酶相當(dāng)。除此之外，其他突變體對(duì)各受體底物的轉(zhuǎn)糖苷活性都有不同程度的下降，甚至對(duì)部分底物失去活性。

表4 LMsp及突變體對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率Table 4 Conversion efficiencies of LMsp and mutants toward substrate

3 討 論

本研究從腸膜明串珠菌ATCC 12291基因組中克隆得到了蔗糖磷酸化酶基因lmsp，并在大腸桿菌M15中成功實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。目的酶蛋白分子質(zhì)量大小約為56 kDa，最適溫度為40 ℃，最適pH值為6.5，在25～40 ℃、pH 4.5～8.0條件下能保持酶活力穩(wěn)定。Lee等[20]報(bào)道來自腸膜明串珠菌NRRL B1149的蔗糖磷酸化酶的最適溫度為37 ℃，李群良等[21]測(cè)定來源于Bacillus megateriumNCIB 8508的蔗糖磷酸化酶最適溫度為50 ℃，最適pH值為7.5，一定程度上表明不同來源的酶在酶學(xué)性質(zhì)上表現(xiàn)有差異，這是在菌株需要不斷適應(yīng)外界環(huán)境而長(zhǎng)期進(jìn)化造成的。在以蔗糖為底物時(shí)Km為（34.16±1.219）mmol/L，Vmax值為（370.5±6.049）μmol/（mg·min）。LMsp對(duì)D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖醇、D-半乳糖、D-甘露糖、D-果糖、D-葡萄糖、L-山梨糖具有轉(zhuǎn)糖苷活性。

為找到影響轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)的關(guān)鍵殘基位點(diǎn)，以提高轉(zhuǎn)糖苷活性，對(duì)其進(jìn)行了分子改造。依據(jù)Morler等[22]的距離定義即：離活性中心距離超過10 ?即被認(rèn)定為遠(yuǎn)距離位點(diǎn)。以青春雙歧桿菌蔗糖磷酸化酶的3D結(jié)構(gòu)為模板，建立了LMsp的蛋白質(zhì)三維模型。并結(jié)合同源蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列比對(duì)分析，選取了距離LMsp親核試劑Asp 196位點(diǎn)10 ?以內(nèi)的T180、T219、P236三個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)及累積突變，獲得了7 個(gè)近距離突變體。其中突變體T180A、P236S對(duì)L-山梨糖的轉(zhuǎn)糖苷活性有所提高，對(duì)其他一些受體底物則出現(xiàn)了反向變化。

為解釋性質(zhì)改善的原因，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，蘇氨酸與丙氨酸相比，R基上多一個(gè)羥基和甲基，空間結(jié)構(gòu)較復(fù)雜。脯氨酸是一種有著環(huán)狀結(jié)構(gòu)的亞氨基酸，其空間結(jié)構(gòu)比絲氨酸更加復(fù)雜，空間位阻更大。因此當(dāng)180、236位點(diǎn)上的蘇氨酸和脯氨酸突變成為空間位阻較小的丙氨酸和絲氨酸時(shí)，酶的活性口袋更容易與底物相契合，使得酶對(duì)這些底物的轉(zhuǎn)糖苷活性上升。突變體T180A、P236S對(duì)L-山梨糖的轉(zhuǎn)糖苷活性均有所提高，而T180AP236S聯(lián)合突變體對(duì)于山梨糖的活性卻發(fā)生了降低，即多位點(diǎn)的相互疊加并不會(huì)把單點(diǎn)突變的優(yōu)勢(shì)疊加起來，反而造成了活性的減弱。結(jié)合建模分析，推測(cè)由于突變后氨基酸空間結(jié)構(gòu)改變對(duì)相鄰氨基酸產(chǎn)生了影響，酶的空間構(gòu)象發(fā)生變化，造成了底物與酶在誘導(dǎo)契合過程中產(chǎn)生了阻礙作用。

為改善酶學(xué)特性，遠(yuǎn)距離突變的改造方案也曾被采用，并取得了一定成果。Whittle等[23]曾在距離活性中心19 ?的位置進(jìn)行了突變，使酶活力增強(qiáng)了32 倍。Van Den Heuvel等[24]在距離活性中心遠(yuǎn)達(dá)32 ?的位置引入突變，使酶活力增強(qiáng)了4.2 倍。一定程度上表明了遠(yuǎn)距離的氨基酸變化可以通過一系列的接觸傳遞到活性中心，從而影響酶活力。此外，基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)能量預(yù)測(cè)的方法也有很多成功的例子[25-27]，能量最低化對(duì)于穩(wěn)定蛋白性質(zhì)及提高產(chǎn)物得率也是一個(gè)很好的方法。本研究豐富了蔗糖磷酸化酶資源的性質(zhì)數(shù)據(jù)，獲得了部分性質(zhì)具有改善的突變酶，為進(jìn)一步對(duì)于蔗糖磷酸化酶的分子改造提供了寶貴經(jīng)驗(yàn)。