劉 曄，朱媛媛，馮 緯，周利南，梁新樂

（1.杭州市食品釀造有限公司，浙江 杭州 310021；2.浙江五味和食品有限公司，浙江 湖州 313213；3.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018）

豆醬是我國傳統(tǒng)特色調(diào)味品，其作為發(fā)酵豆制品，不僅滋味鮮美、富含蛋白質(zhì)，而且還含有異黃酮、多酚及類黑精等生理活性物質(zhì)[1-2]，廣受消費(fèi)者的喜愛。現(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)豆醬主要依賴于米曲霉培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的蛋白酶、淀粉酶等分解原料中的蛋白質(zhì)、淀粉類成分，形成多肽、氨基酸和糖類等物質(zhì)，從而獲得豆醬獨(dú)特的風(fēng)味[3-4]。

目前，國內(nèi)釀造醬企業(yè)，普遍采用米曲霉（Aspergillus oryzae）滬釀3.042作為發(fā)酵菌株，其具有蛋白酶活力高，生長快、安全等特點(diǎn)[5]。豆醬發(fā)酵環(huán)境的pH值一般在4.6～5.0之間，屬于偏酸性環(huán)境，在此發(fā)酵條件下，中、堿性蛋白酶活力受到抑制，對(duì)原料蛋白質(zhì)分解利用不徹底。因此，選育高產(chǎn)酸性蛋白酶菌株有利于豆醬的發(fā)酵[6-7]。鑒于豆醬發(fā)酵主要是由米曲霉分泌的水解酶起作用，因此，對(duì)于米曲霉胞外分泌蛋白的研究將有利于探究豆醬發(fā)酵的機(jī)理以及篩選優(yōu)良菌種。ODA K等[8]首先運(yùn)用雙向凝膠電泳（twodimentional electrophoresis，2-DE）技術(shù)比較了米曲霉RIB40在固體和液體培養(yǎng)條件下胞外蛋白的分泌情況，共鑒定出29種蛋白，包括淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、肽酶以及纖維素降解酶等；LIANG Y C等[9]利用單向電泳技術(shù)研究了A.oryzae3.042在大豆制曲過程中胞外蛋白圖譜，并結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間/飛行時(shí)間-質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight/time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF-MS）技術(shù)鑒定出多種和大豆水解相關(guān)的蛋白酶；ZHANG B等[10]運(yùn)用2-DE技術(shù)研究了紹興米酒曲中米曲霉分泌的蛋白質(zhì)組，共鑒定出41個(gè)蛋白，在2-DE圖譜上，70%的蛋白質(zhì)屬于淀粉酶及其水解產(chǎn)物；ZHAO G Z等[5]運(yùn)用2-DE技術(shù)對(duì)A.oryzae3.042和突變株A100-8的胞內(nèi)蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了比較研究，共鑒定出522個(gè)蛋白點(diǎn)，其中451個(gè)為差異蛋白點(diǎn)，且參與糖酵解、氨基酸合成代謝、次級(jí)代謝過程的蛋白與釀造醬油的風(fēng)味相關(guān)，在蛋白組水平揭示了菌株A100-8發(fā)酵醬油風(fēng)味比米曲霉3.042好。

本研究采用從種曲車間分離得到的中性蛋白酶、酸性蛋白酶、淀粉酶及糖化酶活力較高、產(chǎn)酶特性較好、不產(chǎn)生黃曲霉毒素的米曲霉ZJGS-LZ-12為研究對(duì)象，以米曲霉3.042為對(duì)照，采用2-DE技術(shù)研究米曲霉ZJGS-LZ-12與3.042的分泌蛋白組差異，確證米曲霉ZJGS-LZ-12的酶學(xué)輪廓及其在豆醬中的工業(yè)價(jià)值，為該菌株的后期應(yīng)用及工業(yè)米曲霉菌種的發(fā)酵酶學(xué)研究提供重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

米曲霉（Aspergillus oryzae）3.042：實(shí)驗(yàn)室保存；米曲霉ZJGS-LZ-12：浙江五味和食品有限公司種曲車間分離，實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

硫脲、尿素、溴酚藍(lán)（均為分析純）、固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）膠條（pH 4～7）：美國Bio-Rad公司；非變性兩性離子去垢劑、蛋白酶抑制劑：中國BIOSHARP公司；考馬斯亮藍(lán)G-250：德國Sigma公司；無水乙醇、甲醇（均為分析純）：杭州化學(xué)試劑有限公司；磷酸（分析純）：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；丙酮（分析純）：杭州雙林化工試劑廠；乙酸（分析純）：江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；硫酸銨（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

豆汁斜面培養(yǎng)基：豆汁1 000 mL，可溶性淀粉20 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.5 g，（NH4）2SO40.5 g，瓊脂20 g，自然pH，115 ℃滅菌30 min。豆汁：按豆粕質(zhì)量加5～6倍水，煮沸1 h，過濾，每100 g豆粕制成5 Bé 豆汁100 mL。

麩皮固體培養(yǎng)基[11]：麩皮80 g，面粉20 g，蒸餾水80 mL，115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Protean IEF cell等電聚焦電泳儀、PowerPac Universal垂直板電泳儀、Protean II xi電泳灌膠模具、GS-800高分辨專業(yè)掃描儀、PDQuest 8.0雙向電泳圖像分析軟件、Mini-Protein cell II電泳系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；Biofuge stratos臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)、Forma 702超低溫冰箱：美國Thermo Scientific公司；Milli-Q超純水裝置系統(tǒng)：美國Millipore公司；AF-10制冰機(jī)：美國Scotsman公司；Eppendorf移液槍：德國Eppendorf公司；DELTA 320標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì)：瑞士Mettler Toledo公司；4800 MALDI-TOF/TOF-MS儀：美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 種曲的制備

米曲霉的活化：在無菌條件下，用接種環(huán)挑取米曲霉孢子接種到豆汁斜面培養(yǎng)基上，30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)3～5 d。

種曲的制備：在無菌條件下，用接種環(huán)挑取斜面菌種轉(zhuǎn)接于麩皮固體培養(yǎng)基，搖勻，30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)18～20 h，搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)至72 h，米曲霉生長成熟，即為豆醬種曲。

1.3.2 米曲霉胞外蛋白的提取與處理

胞外蛋白提?。悍Q取25 g新鮮的種曲樣品于500 mL三角瓶，加入50 mL胞外蛋白提取劑（含1‰蛋白酶抑制劑的0.05 mol/L乙酸緩沖液），輕輕搖晃，使曲料完全浸入提取液中，置于4 ℃冰箱中靜置12 h。浸提完成后，首先用8層紗布過濾除去曲料中的麩皮、豆粕等物質(zhì)，然后將得到的蛋白濾液在4 ℃、13 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，同樣條件下離心10 min，以除去濾液中不溶的雜質(zhì)。離心后的上清液經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾，即為米曲霉胞外蛋白，于-80 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

胞外蛋白處理：參照文獻(xiàn)[12]的方法，并稍加改動(dòng)，對(duì)胞外蛋白進(jìn)行處理。按照體積比1∶4向胞外蛋白樣品中加入-20 ℃預(yù)冷的丙酮，混勻，于-20 ℃條件下靜置2 h，混勻，于4 ℃、5 000 r/min條件下離心10 min，棄上清液，同樣條件下離心1 min，棄丙酮液體。沉淀物用氮?dú)獯蹈桑尤脒m量的裂解液（尿素12 g，硫脲3.8 g，非變性兩性離子去垢劑1 g，無菌水25 mL），間隔振蕩至沉淀溶解，于4 ℃、15 000 r/min條件下離心1 min除去不溶物。

蛋白含量的測(cè)定：采用Bradford蛋白定量法[13]對(duì)樣品蛋白濃度進(jìn)行定量。

1.3.3 雙向電泳

第一向是等電聚焦，選用pH 4～7的IPG膠條水化上樣，考染，蛋白上樣量400 μg、上樣體積300 μL，在等點(diǎn)聚焦程序II（延長除鹽時(shí)間（5 h）和聚焦時(shí)間（80 000 vhr））條件下進(jìn)行2-DE實(shí)驗(yàn)。第一向完成后，取出膠條，轉(zhuǎn)移到聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行第二向電泳。電泳完成后，采用PDQuest專業(yè)圖像分析軟件分析比對(duì)2-DE圖譜，比較不同組間的蛋白點(diǎn)。如果某一蛋白點(diǎn)的表達(dá)量的相對(duì)比值≥1.5或≤0.5，且P＜0.05，則將該點(diǎn)判定為差異表達(dá)蛋白點(diǎn)。當(dāng)某個(gè)蛋白點(diǎn)的表達(dá)量的相對(duì)比值≥1.5時(shí)，為分泌表達(dá)量上調(diào)；當(dāng)?shù)鞍c(diǎn)的表達(dá)量的相對(duì)比值≤0.5時(shí)，為分泌表達(dá)量下調(diào)。

1.3.4 差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

參照文獻(xiàn)[8]的方法對(duì)差異蛋白進(jìn)行鑒定。質(zhì)譜條件：采用反射模式采集每個(gè)蛋白質(zhì)的一級(jí)質(zhì)譜（MS）信息，激光強(qiáng)度4 000，質(zhì)量范圍800～4 000 Da。一級(jí)質(zhì)譜掃描完成后，選取7個(gè)信號(hào)強(qiáng)度最高的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）分析，加速電壓2000 V，采用誘導(dǎo)碰撞解離（collision-induced dissociation，CID）碰撞裂解母離子，獲取每個(gè)母離子的離子碎片指紋譜。

定性分析：MS及MS/MS數(shù)據(jù)通過MASCOT軟件中的applied biosystems對(duì)美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）和Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索。檢索參數(shù)為：米曲霉、胰蛋白酶酶解、最大漏切位點(diǎn)1個(gè)，固定修飾方式：半胱氨酸脲甲基化進(jìn)行固定修飾、甲硫氨酸氧化進(jìn)行可變修飾，肽段質(zhì)量精確度±0.3 Da，置信度＞95%具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3.5 差異蛋白點(diǎn)的生物信息學(xué)分析

利用生物信息學(xué)手段對(duì)鑒定的米曲霉蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。使用SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）[14]預(yù)測(cè)信號(hào)肽、UniProt（http：//www.uniprot.org/uniprot/）[15]和QuickGO（http：//www.ebi.ac.uk/QuickGO/）數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。通過ExPASy的pI/MW工具（http：//www.expasy.org/tools/pi_tool.html）[16]獲得蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)和分子質(zhì)量。通過WoLFPSORT program（http：//wolfpsort.org/）[9]對(duì)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞進(jìn)行定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 米曲霉ZJGS-LZ-12胞外蛋白質(zhì)分泌量的檢測(cè)

比較米曲霉3.042和ZJGS-LZ-12在種曲中胞外蛋白質(zhì)的分泌量，結(jié)果見圖1。

圖1 米曲霉3.042和ZJGS-LZ-12胞外蛋白質(zhì)的分泌量Fig.1 Secretion volume of extracellular proteins by Aspergillus oryzae 3.042 and ZJGS-LZ-12

由圖1可知，米曲霉3.042和ZJGS-LZ-12胞外蛋白質(zhì)的分泌量分別為（175.78±6.07）μg/g干曲和（183.52±23.07）μg/g干曲。結(jié)果表明，兩株米曲霉的胞外蛋白分泌能力相當(dāng)。

2.2 米曲霉ZJGS-LZ-12分泌蛋白組的雙向電泳圖譜及差異蛋白質(zhì)分析

米曲霉3.042和ZJGS-LZ-12的胞外蛋白雙向電泳圖譜見圖2。

圖2 米曲霉3.042（A）及ZJGS-LZ-12（B）分泌蛋白組的雙向電泳圖譜Fig.2 Two dimentional electrophoresis pattern of secretome of Aspergillus oryzae 3.042 (A) and ZJGS-LZ-12 (B)

由圖2可知，經(jīng)PD Quest軟件進(jìn)行定性、定量分析，在米曲霉3.042和ZJGS-LZ-21的2-DE圖譜上分別檢測(cè)到552±21和586±18個(gè)蛋白點(diǎn)，與米曲霉3.042相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)蛋白點(diǎn)共有169個(gè)（P＜0.05），其中80個(gè)蛋白點(diǎn)分泌表達(dá)量下調(diào)，89個(gè)蛋白點(diǎn)分泌表達(dá)量上調(diào)。對(duì)169個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)庫檢索，結(jié)果有105個(gè)蛋白點(diǎn)被鑒定成功，占總蛋白點(diǎn)數(shù)的62.1%。根據(jù)蛋白點(diǎn)的肽指紋圖譜，共檢索到27個(gè)差異蛋白質(zhì)。結(jié)合NCBI和Uniprot數(shù)據(jù)庫，對(duì)鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行QuickGO蛋白功能聚類分析，結(jié)果見表1。其中3個(gè)蛋白（Q9HGY9、Q2ULB2及P80402）不屬于分泌蛋白，不予以分析。

表1 米曲霉ZJGS-LZ-12和3.042胞外差異表達(dá)蛋白的鑒定Table 1 Identification of extracellular differential proteins expressed by Aspergillus oryzae ZJGS-LZ-12 and 3.042

續(xù)表

2.3 米曲霉ZJGS-LZ-12差異蛋白質(zhì)生物功能性分類及解析

A.oryzae3.042和ZJGS-LZ-12胞外差異表達(dá)蛋白質(zhì)的功能性分類見圖3。由圖3A可知，差異蛋白質(zhì)主要參與糖類和蛋白質(zhì)水解過程，分別占總蛋白質(zhì)的65.22%和26.09%；4.35%的蛋白質(zhì)參與氧化還原等過程。由圖3B可知，差異蛋白質(zhì)主要是水解淀粉、纖維素、半纖維素及蛋白質(zhì)的酶。其中，66.6%淀粉水解酶和75%半纖維素酶分泌表達(dá)量上調(diào)，33.3%淀粉水解酶和25%半纖維素酶分泌表達(dá)量下調(diào)；33.3%蛋白酶和肽酶分泌表達(dá)量上調(diào)，其余分泌表達(dá)量下調(diào)；纖維素酶及氧化還原酶分泌表達(dá)量均下調(diào)。結(jié)果表明，大部分蛋白酶參與糖類和蛋白質(zhì)的分解代謝，與制曲過程中胞外蛋白變化相一致[8]。分析原因可能是在固態(tài)發(fā)酵條件下，米曲霉必須分泌大量的水解酶降解麩皮等原料中的糖類和蛋白質(zhì)，以獲得生長所必須的營養(yǎng)物質(zhì)。

大豆等制曲材料中的淀粉，只有先經(jīng)制曲發(fā)酵，被米曲霉分泌的淀粉酶和糖化酶水解，才能在后期發(fā)酵中被酵母和細(xì)菌利用。由表1可知，蛋白點(diǎn)13、108和201是α-淀粉酶A，與米曲霉3.042相比，米曲霉ZJGS-LZ-12的蛋白點(diǎn)13和201分泌表達(dá)量上調(diào)3.24～5.05倍，而蛋白點(diǎn)108分泌表達(dá)量下調(diào)，說明不同α-淀粉酶A分泌表達(dá)量存在差異。LIANG Y C等[9]對(duì)紹興米酒曲中米曲霉SU16的胞外蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶和它的水解產(chǎn)物占凝膠上可視蛋白點(diǎn)的70%以上；ODA K等[8]研究發(fā)現(xiàn)，利用蒸煮后的麥麩進(jìn)行制曲，米曲霉RIB40分泌的α-淀粉酶和它的水解產(chǎn)物占凝膠上可視蛋白點(diǎn)的50%以上。這些研究結(jié)果表明，在制曲過程中，米曲霉都具有較強(qiáng)的分泌淀粉酶的能力。本研究中經(jīng)PD Quest分析顯示，米曲霉ZJGS-LZ-12分泌的α-淀粉酶和它的水解產(chǎn)物占凝膠上可視點(diǎn)的60%以上，遠(yuǎn)高于米曲霉3.042（40%），預(yù)示著米曲霉ZJGS-LZ-12在豆醬發(fā)酵中的優(yōu)良性能。α-淀粉酶通過水解淀粉的α-1,4-糖苷鍵生成麥芽糖、葡萄糖等還原糖，可與醬醅中的氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)，形成豆醬色素，生成的酯類還可增加豆醬的香氣，與豆醬的色澤和香氣的形成有重要的關(guān)系[5，12]。另外，葡萄糖也是酵母菌和細(xì)菌生長所必須的碳源，酵母菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乙醇，細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乳酸、醋酸及琥珀酸，這些醇類和有機(jī)酸是豆醬香氣的重要組成成分。

圖3 米曲霉胞外差異表達(dá)蛋白質(zhì)的功能分類Fig.3 Functional classification for extracellular differential proteins expressed by Aspergillus oryzae

蛋白點(diǎn)73、187和124被鑒定為糖化酶。糖化酶又稱為葡萄糖淀粉酶，由基因glaA編碼，其能水解淀粉非還原性未端的α-1,4葡萄糖苷鍵產(chǎn)生葡萄糖，也能緩慢水解α-1,6葡萄糖苷鍵，轉(zhuǎn)化為葡萄糖。米曲霉ZJGS-LZ-12的蛋白點(diǎn)73、187和124的分泌表達(dá)量下調(diào)0.10～0.36倍，說明米曲霉ZJGS-LZ-12分泌的糖化酶量比米曲霉3.042少。

蛋白點(diǎn)136、219、171和198被鑒定為纖維素酶，其中，蛋白點(diǎn)136為β-半乳糖苷酶A，米曲霉ZJGS-LZ-12分泌表達(dá)量上調(diào)1156倍，而另外3種分別為α/β葡萄糖苷酶agdC、β-1,4-D-葡聚纖維二糖水解酶A、β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶B，分泌表達(dá)量均下調(diào)。其中，α/β-葡萄糖苷酶agdC具有α-葡糖苷酶和β-葡糖苷酶活性，參與細(xì)胞壁中纖維素的降解，生成D-葡萄糖。

蛋白點(diǎn)220、166、205、125、217、110、145、147和148被鑒定為半纖維素酶，其中米曲霉ZJGS-LZ-12的依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸）（nicotinamide adenine dinucleotide（phosphate），NAD（P）H）D-木糖氧化還原酶xyl1和乙酰木聚糖酯酶A分泌表達(dá)量下調(diào)，其余分泌表達(dá)量均上調(diào)。在分泌表達(dá)量上調(diào)的蛋白中，β-1,4-外切木聚糖酶bxlB參與木聚糖的水解，水解β-1,4-D-木聚糖，從非還原末端依次切掉D-木糖殘基生成D-木糖，與豆醬香味及色澤形成有關(guān)。阿拉伯半乳聚糖-β-1,4-內(nèi)切半乳聚糖酶A參與植物細(xì)胞壁多糖物質(zhì)的降解，可水解I類阿拉伯半乳聚糖（arabogalactan，AGs），特異性作用于1,4-半乳糖苷鏈[17]。將AGs降解為低聚糖，供菌體生長利用。葡聚糖β-1,3-葡糖苷酶A參與β-葡聚糖的降解，從非還原末端切掉β-D-葡萄糖，釋放α-葡萄糖，生成的木糖、葡萄糖等產(chǎn)物與豆醬發(fā)酵過程中風(fēng)味和色澤的形成有直接的關(guān)系。β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶和乙酰木聚糖酯酶A參與木聚糖的降解，其中內(nèi)切木聚糖酶水解木聚糖的主鏈生成低聚木糖及木糖；乙酰木聚糖酯酶A水解木聚糖上乙酰化的側(cè)鏈，提高內(nèi)切木聚糖酶降解木聚糖的速度[18]。

在差異胞外蛋白質(zhì)中，也有很多蛋白質(zhì)被鑒定為降解酶，分別是亮氨酸氨基肽酶A（leucine aminopeptidase A，Lap A）（蛋白點(diǎn)126、168、215）、亮氨酸氨基肽酶A2（leucine aminopeptidase A2，Lap A2）（蛋白點(diǎn)41）、二肽水解酶5（蛋白點(diǎn)174）、中性蛋白酶2（neutral protease 2，Ntp 2）（蛋白點(diǎn)200）、堿性蛋白酶1（alkaline protease 1，Alp 1）（蛋白點(diǎn)114和194）及天冬氨酸肽酶（aspartyl aminopeptidase）（蛋白點(diǎn)222）和天冬氨酸蛋白酶（aspartic protease pep1，Pep1）（蛋白點(diǎn)106）。

亮氨酸氨基肽酶（Laps）屬于鋅需要型金屬蛋白酶類中的外肽酶，外肽酶在豆醬的工業(yè)生產(chǎn)中具有重要的作用，其能降解肽產(chǎn)生氨基酸，增加豆醬的鮮味[19]。米曲霉ZJGS-LZ-12的LapA（蛋白點(diǎn)215）分泌表達(dá)量上調(diào)2.33倍，而Lap2（蛋白點(diǎn)41）分泌表達(dá)量下調(diào)0.01倍。Lap2和LapA作用的最適pH值分別為9.5和8.5，偏堿性，在酸性條件下活性大大降低，而豆醬發(fā)酵的環(huán)境一般為4.6～5.0之間，屬于偏酸性環(huán)境，不利于Laps酶促反應(yīng)的進(jìn)行。

蛋白質(zhì)先經(jīng)過內(nèi)肽酶降解為大分子肽，再經(jīng)過Laps和二肽酰多肽酶IV（dipeptidyl-peptidase IV，DppIV）（X-脯氨?；到饷福┑膮f(xié)同作用進(jìn)一步降解為氨基酸。因?yàn)楫?dāng)X-脯氨?；蛄写嬖跁r(shí)，Laps降解肽的反應(yīng)被終止，通過互補(bǔ)的方式，DppIV可以移除X-脯氨?；蛄校瑥亩筁aps繼續(xù)水解氨基酸殘基[20]。

Ntp 2主要在中性pH條件下水解蛋白質(zhì)分子。米曲霉是產(chǎn)工業(yè)蛋白酶的重要真菌之一，米曲霉3.042是我國最常用的生產(chǎn)豆醬的菌株，高產(chǎn)中性蛋白酶，而米曲霉ZJGS-LZ-12的Ntp2（蛋白點(diǎn)200）的分泌表達(dá)量下調(diào)。

Alp1是一種絲氨酸蛋白酶，米曲霉ZJGS-LZ-12的Alp1（蛋白點(diǎn)114）分泌表達(dá)量上調(diào)約1 300倍，降解蛋白質(zhì)分子，生成小分子量的肽，促進(jìn)原料蛋白質(zhì)的利用。

天冬氨酸蛋白酶是一種分泌型內(nèi)肽酶，屬于酸性蛋白酶，在米曲霉ZJGS-LZ-12中，其分泌表達(dá)量上調(diào)100多倍。研究表明，天冬氨酸蛋白酶可以在pH值3.5的條件下水解蛋白質(zhì)（尤其是疏水性殘基）的肽鍵[20]，形成的各種多肽在肽酶作用下進(jìn)一步被水解成游離氨基酸，大豆蛋白被水解生成的可溶性的?、胨、多肽及氨基酸，形成豆醬的營養(yǎng)物質(zhì)氮素成分和鮮味。

3 結(jié)論

米曲霉ZJGS-LZ-12與我國傳統(tǒng)經(jīng)典米曲霉3.042胞外蛋白的分泌能力相當(dāng)，分別為（175.78±6.07）μg/g干曲和（183.52±23.07）μg/g干曲，但胞外分泌蛋白組存在顯著差異（P＜0.05）。雙向電泳結(jié)果表明，與米曲霉3.042相比，米曲霉ZJGS-LZ-12的差異表達(dá)蛋白點(diǎn)共169個(gè)，其中80個(gè)蛋白點(diǎn)分泌表達(dá)量下調(diào)，89個(gè)蛋白點(diǎn)分泌表達(dá)量上調(diào)。通過MALDI-TOF/TOF-MS法共鑒定出105個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，通過和NCBI和Uniprot數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析共發(fā)現(xiàn)27個(gè)差異蛋白質(zhì)。通過差異蛋白質(zhì)生物功能性分析，結(jié)果表明，差異蛋白質(zhì)主要參與糖類和蛋白質(zhì)水解過程，主要是水解淀粉、纖維素、半纖維素及蛋白質(zhì)的酶。其中，淀粉水解酶、半纖維素酶活性顯著增強(qiáng)，β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶F3、β-半乳糖苷酶A和阿拉伯半乳聚糖-β-內(nèi)切半乳聚糖酶A分泌表達(dá)量分別上調(diào)292、1 156和2 569倍；而蛋白酶Pep1和Alp1分泌表達(dá)量分別上調(diào)100和1 300倍。表明米曲霉ZJGS-LZ-12的分泌蛋白組具有較獨(dú)特的組成及活性，有利于降解大豆蛋白并提高原料利用率及豆醬的風(fēng)味和營養(yǎng)。因此，米曲霉ZJGS-LZ-12是一株比較優(yōu)良的工業(yè)菌株，適合用于豆醬的發(fā)酵生產(chǎn)。