左麗麗，高永欣，王舒然，富校軼

（吉林醫(yī)藥學院 公共衛(wèi)生學院，吉林 吉林 132013）

本研究以吉林市農(nóng)家自制大醬為試材，在傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬發(fā)酵過程中，利用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術，結合分子生物學手段及相關軟件對不同發(fā)酵周期大醬中細菌的變化規(guī)律進行分析，通過研究該發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群及變化規(guī)律，為傳統(tǒng)發(fā)酵大醬的制作工藝及進一步研究其品質及風味物質的形成機理提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

農(nóng)家大醬：采用東北傳統(tǒng)方法制成[13]。

甲酰胺、四甲基乙二胺（tetramethylethylene diamine，TEMED）、尿素、甲叉丙烯酰胺、過硫酸銨：美國AMRESCO公司；氨芐青霉素、X-Gal、異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）：大連美侖生物技術有限公司；RNaseA：北京索萊寶科技有限公司；硫酸鎂、丙三醇、Tris-Base、冰乙酸、氫氧化鈉、氯化鈉、碳酸鈣：天津市大茂化學試劑有限公司；乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）：美國AMRESCO公司；瓊脂：北京金泰宏達生物科技有限公司。實驗試劑均為分析純。

Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；細菌通用引物27f、1495R、1492R、518R、338F（27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1495R：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'；1492R：5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'；GC-338F：5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'；518R：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'）：均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。2×TaqPCR MasterMix：購于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

GI54DWS高壓滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；5430R型高速冷凍離心機、6331PCR儀：德國eppendorf公司；HZL-F100恒溫雙層振蕩培養(yǎng)箱：太倉市強樂實驗設備有限公司；FE20K pH計：METTLER TOLEDO公司；ChemiDoc XRS＋凝膠成像系統(tǒng)、1645050電泳儀：美國BIO-RAD公司；GWA-UN4-C30超純水處理系統(tǒng)：北京普析通用儀器有限責任公司；JNOEC XS-212-201生物顯微鏡：日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集

采集1～10周不同發(fā)酵時期的傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬各50 g，記錄發(fā)酵過程及時間等信息，置于10 mL滅菌離心管中，運回實驗室于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，人們對生活質量的要求越來越高，越來越多的人涌進城市，使得我國的城市化水平不斷提高。青島市作為我國經(jīng)濟發(fā)展迅速的城市，同時作為美麗的海濱城市，其人口城市化率每年都在提高（見圖1）。

1.3.2 豆醬總DNA的提取

稱取不同發(fā)酵周期一定質量的豆醬，置于2 mL離心管中，離心去除大部分水分，用土壤基因組DNA快速提取試劑盒提取豆醬總DNA，測定DNA的濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測[14-15]，置于-20 ℃保存。

1.3.3 16S rDNA PCR擴增

以上述提取的豆醬總DNA進行16S rDNA擴增，豆醬總DNA為模板，27F/1492R為引物，產(chǎn)物長度約為1 500 bp。PCR擴增體系：DNA模板1 μL，引物27F 1 μL，引物1492R 1 μL、2×TaqPCR Master mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；72 ℃后延伸10 min[16-17]。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳驗證后，作為巢式PCR的模板。

以上述的PCR產(chǎn)物為模板，GC338F/518R為引物PCR擴增細菌16S rDNA V3可變區(qū)間，產(chǎn)物長度約為250 bp。PCR擴增體系與上述相同。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，65～55 ℃退火45 s（每個循環(huán)降低0.5 ℃），72 ℃延伸30 s，20個循環(huán)，94 ℃變性40 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，15個循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過2%瓊脂糖凝膠電泳驗證，作為變性梯度電泳樣品。

1.3.4 變性梯度凝膠電泳

采用Bio-Rad公司的DGGE系統(tǒng)對上述PCR擴增產(chǎn)物進行電泳分離分析。聚丙烯酰胺濃度為8%，變性梯度為35%～65%，電泳條件為1×TAE 緩沖液，恒溫60 ℃、恒壓80 V，電泳720 min[18-19]。電泳結束后分別用固定液、銀染液、顯色液洗滌，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.5 DGGE圖譜分析

利用凝膠系統(tǒng)自帶的軟件quantityone對DGGE的圖片進行分析，根據(jù)圖片中條帶的數(shù)量及灰度計算樣品的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H），Margalef豐富度指數(shù)（D）以及Pielou均勻度指數(shù)（E），對豆醬中細菌的多樣性進行分析[20]。

1.3.6 DGGE條帶的回收、克隆及測序

分別切膠回收DGGE圖譜中的優(yōu)勢條帶，加適量超純水過夜溶解片段，取上清液，以不帶GC夾板的引物338F/518R擴增細菌16S rDNA V3區(qū)。反應體系及程序與帶GC夾板的一致。目標片段經(jīng)過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，-20 ℃冰箱保存，作為后續(xù)克隆的目的片段。采用pMD18-T Vector Cloning Kit克隆目的片段，挑陽性克隆子培養(yǎng)，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.7 乳酸菌16S rDNA同源性分析及種屬鑒定

登錄美國國立生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），對測序結果進行同源性分析，從數(shù)據(jù)庫中得到相關種屬的細菌16S rDNA序列信息。以16S rDNA的序列同源性＞99%為標準進行屬種歸類。然后再對待測菌株與模式菌株16S rDNA序列利用程序MEGA7.0中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，進一步進行種屬鑒定。

2 結果與分析

2.1 傳統(tǒng)發(fā)酵大醬細菌16S rDNA、16S rDNA V3區(qū)PCR擴增結果

圖1 細菌16S rDNA（A）、16S rDNA V3區(qū)（B）PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification results of 16S rDNA (A) and 16S rDNA V3(B) regions gene of bacteria

以27F/1492R、GC-338F/518R 引 物PCR擴增細菌16SrDNA、16SrDNAV3區(qū)序列，分別得到大小約為1500bp、250 bp左右的目的片段，結果如圖1所示，說明目的片段擴增成功。

2.2 DGGE指紋圖譜分析

大醬發(fā)酵過程中1～10周細菌16S rDNA V3區(qū)變性梯度凝膠電泳結果如圖2所示。

圖2 豆醬發(fā)酵過程中1～10周細菌16S rDNA V3區(qū)DGGE指紋圖譜Fig.2 DGGE fingerprint of bacterial 16S rDNA V3 regions during fermentation process of 1-10 weeks of soybean pastes

DGGE圖譜中每一泳道條帶的數(shù)量代表菌落的遺傳多樣性，亮度強弱代表細菌數(shù)量的多少。由圖2可知，發(fā)酵前期1～5周各泳道的條帶數(shù)目相近，但各條帶的遷移率及亮度均有一定差異，說明發(fā)酵過程中，細菌的種類和數(shù)量發(fā)生了一定程度的變化。條帶①、⑤、⑧、存在于發(fā)酵的整個周期中，且亮度比較大，對應的菌即為整個發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌。條帶②、③、④只存在于泳道1、2和5中，其所對應的菌可能是發(fā)酵前期帶入的雜菌，隨著發(fā)酵的不斷進行，菌體逐漸消失。條帶出現(xiàn)在發(fā)酵中后期，對應的菌可能是發(fā)酵過程中產(chǎn)生的優(yōu)勢菌。

2.3 細菌多樣性結果分析

表1 不同發(fā)酵周期豆醬中細菌菌群多樣性分析Table 1 Bacterial diversity analysis of soybean pastes at different fermentation periods

電泳圖譜中條帶多少可直觀反映豆醬樣品中細菌種群的遺傳多樣性，多樣性指數(shù)是研究群落物種數(shù)和個體數(shù)及其分布均勻度的綜合指標。根據(jù)圖譜條帶信息，采用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H）、Margalef豐富度指數(shù)（D）以及Pielou均勻度指數(shù)（E）對細菌的多樣性進行分析，結果如表1所示。

由表1可知，不同發(fā)酵周期豆醬中細菌的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)均表現(xiàn)出一定的差異，而均勻度則非常的接近。發(fā)酵第2周樣品具有較高的細菌豐度及多樣性，可能是由于發(fā)酵初期帶入的雜菌所導致。隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵中期（第5周后）時優(yōu)勢菌生長，保持菌群結構的穩(wěn)定。發(fā)酵后期，細菌豐富度指數(shù)在第9周達最高，但和中期差別不顯著。以上結果與DGGE圖譜的直觀結果一致。

2.4 測序及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

細菌DGGE圖譜中，選取15個標記的亮度高、分離清晰的條帶，經(jīng)過切膠回收、純化連接、克隆轉化、測序后，將測序結果在NCBI上進行BLAST比對，測序結果如表2所示。由表2可知，在所測的15個條帶中得到的相似序列主要有戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceu）、乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）、葡萄球菌屬（Staphylococcussp.）、屎腸球菌（Enterococcus faecium）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），是發(fā)酵周期的優(yōu)勢菌群，存在于發(fā)酵整個過程，而弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）、霍氏腸桿菌（Enterobacter hormaechei）、產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）、不可培養(yǎng)的桿菌（Uncultured bacterium）存在于發(fā)酵的中后期，對后期大醬風味的形成起到一定的改善作用。

表2 DGGE優(yōu)勢條帶測序比對結果Table 2 Sequencing alignments results of dominate DGGE bands

MEGA7.0軟件構建細菌系統(tǒng)發(fā)育樹，NJ法自展數(shù)（bootstrap）為1000，結果如圖3所示，從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，所有分離菌株與相應的參考菌株同源性很高，并與其聚在一起，證明乳酸菌16S rDNA區(qū)域序列分析結果的準確性。

圖3 豆醬中細菌的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of bacteria in soybean pastes based on 16S rDNA

3 結論

本實驗利用PCR-DGGE技術分析吉林市農(nóng)家自制大醬不同發(fā)酵階段細菌的生物多樣性及變化規(guī)律，結果表明大醬發(fā)酵過程中細菌菌群種類較為豐富，有戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceu）、乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）、葡萄球菌屬（Staphylococcussp.）、屎腸球菌（Enterococcus faecium）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）、霍氏腸桿菌（Enterobacter hormaechei）、產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）、不可培養(yǎng)的桿菌（Uncultured bacterium）。其中戊糖片球菌、乳明串珠菌、葡萄球菌屬、屎腸球菌、解淀粉芽孢桿菌是發(fā)酵全程的優(yōu)勢菌，弗氏檸檬酸桿菌、霍氏腸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、不可培養(yǎng)的桿菌為發(fā)酵后期優(yōu)勢菌。在整個發(fā)酵過程中乳酸菌相對較多，為發(fā)酵的優(yōu)勢菌群，對豆醬的風味起著主要作用。結合相關分析軟件表明，發(fā)酵過程中不同周期細菌的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)存在一定的差異，均勻度比較接近，通過系統(tǒng)發(fā)育樹可知，各細菌之間具有一定的親緣關系，這促進了傳統(tǒng)發(fā)酵大醬制作工藝的發(fā)展，為進一步品質變化及風味物質的形成機理提供理論支持，同時也為大醬的進一步開發(fā)利用提供科學依據(jù)。