馬巖石，姜 明，劉振艷，陳曉婷，裴芳藝

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 科研處，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

酵母菌是人類文明史上利用得最早的微生物，屬于兼性厭氧菌，其中釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）利用最為普遍[1]。S.cerevisiae是一類用途廣泛、研究透徹的單細(xì)胞真菌，作為重要的生產(chǎn)用微生物，在醫(yī)藥、食品和生物能源等方面受到人們的倍加重視[2]。S.cerevisiae在以葡萄糖為底物的發(fā)酵過程中，營養(yǎng)物質(zhì)除用于菌株生長所必需的蛋白質(zhì)和核酸等合成外，還會(huì)產(chǎn)生一些中間代謝產(chǎn)物和副產(chǎn)物[3]。研究表明，S.cerevisiae作為模式生物，易于培養(yǎng)、繁殖迅速、代謝產(chǎn)物少、碳源利用率高以及可存活于較低pH環(huán)境，這也就意味著在有限的營養(yǎng)供應(yīng)和相對(duì)惡劣的條件下能完成大規(guī)模的產(chǎn)物積累[4-7]。作為公認(rèn)安全（generally regarded as safe，GRAS）微生物，S.cerevisiae遺傳操作技術(shù)成熟，蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因組學(xué)的有關(guān)理論研究較為清楚，而且自身具有完整的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的加工后修飾能力，為S.cerevisiae的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[8]。與細(xì)菌相比，S.cerevisiae對(duì)各種環(huán)境制約因子耐受性強(qiáng)，安全無致病性，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了更高的可行性。

中國作為食品生產(chǎn)大國，尤其是發(fā)酵食品、釀酒業(yè)在世界范圍內(nèi)起到舉足輕重的作用。長久以來，S.cerevisiae作為釀酒工業(yè)的主要微生物，對(duì)我國酒精飲料制品的發(fā)展起到重要的影響[9]。乙醇作為S.cerevisiae的主要代謝產(chǎn)物，可以提高酒精飲料的品質(zhì)[10]。S.cerevisiae在代謝過程中還可以產(chǎn)生有機(jī)酸和氨基酸，將其作為發(fā)酵劑或出發(fā)菌株應(yīng)用于食品飲品領(lǐng)域，能改善發(fā)酵制品的風(fēng)味和口感[11]。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，研究者通過多種手段解析S.cerevisiae的代謝途徑，從基因水平以及合成物學(xué)角度探究S.cerevisiae的產(chǎn)物合成機(jī)理，人為地改造菌株，獲得工業(yè)化產(chǎn)品[12-14]。然而，新型S.cerevisiae的分離篩選以及高產(chǎn)量代謝產(chǎn)物菌株的獲得仍是目前研究的工作重點(diǎn)[15]。

在先前的研究中，從東北葡萄果園中篩選出多株高產(chǎn)乙醇的菌株，并鑒定菌株的類別。本研究在此基礎(chǔ)上，以S.cerevisiaeQY-1為研究對(duì)象，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀和全自動(dòng)氨基酸分析儀對(duì)其發(fā)酵過程中葡萄糖消耗量、乙醇生成量、有機(jī)酸及游離氨基酸（free amino acid，F(xiàn)AA）的種類及含量進(jìn)行測(cè)定，研究菌株的發(fā)酵特性，為酵母的食品開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）QY-1：從東北葡萄果園中分離。

1.1.2 試劑

天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸、脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥98%）：賽卡姆（北京）科學(xué)儀器有限公司；葡萄糖、乙醇、無水檸檬酸、α-酮戊二酸、丙酮酸、蘋果酸、琥珀酸、L-乳酸、甲酸、乙酸（純度均≥98%）：上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）瓊脂培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

葡萄糖單碳源發(fā)酵培養(yǎng)基[16]：葡萄糖80 g，酵母提取物5 g，（NH4）2SO42.5 g，KH2PO42.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，無水CaCl20.25 g，蒸餾水1 L，調(diào)pH值至5.0，108 ℃高壓濕熱滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Aminex HPX-87H有機(jī)酸和醇分析柱：美國Bio-Rad公司；S-433D全自動(dòng)氨基酸分析儀：德國Sykam公司；Waters TMe2695型高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography，HPLC）儀：美國Waters公司；22331Hamburg高速離心機(jī)：德國Eppendorf公司；FE28 pH計(jì)：梅特勒-托利多集團(tuán)；V-5000可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；BSP-400生化培養(yǎng)箱：上海博訊有限公司；SPH-110X12往復(fù)式恒溫振蕩水浴培養(yǎng)搖床：上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒酵母QY-1的發(fā)酵

活化：將甘油管保藏的S.cerevisiaeQY-1接種于裝液量為20 mL/50 mL的YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，活化菌株。

種子液制備：將活化后的菌液分三區(qū)劃線于YPD瓊脂培養(yǎng)基平板上，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h。連續(xù)傳代培養(yǎng)3代后，分別挑取生長狀況優(yōu)良的單菌落接種于裝液量為100 mL/250 mL的YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)24 h制備種子液。

發(fā)酵液制備：將種子液以5%（V/V）的接種量接種于葡萄糖單碳源發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、140 r/min培養(yǎng)60 h，每隔6 h取適量發(fā)酵液，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值（OD600nm值），利用pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的pH值。

1.3.2 測(cè)定方法

（1）葡萄糖、乙醇及有機(jī)酸[17]

采用高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵液中的葡萄糖、乙醇和有機(jī)酸含量。HPLC條件：Aminex HPX-87H有機(jī)酸和醇分析柱（300 mm×7.8 mm），流動(dòng)相為0.005 mol/L H2SO4，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長210 nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制不同質(zhì)量濃度（0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L）的葡萄糖、乙醇、無水檸檬酸、α-酮戊二酸、丙酮酸、蘋果酸、琥珀酸、L-乳酸、甲酸、乙酸等標(biāo)準(zhǔn)溶液，取標(biāo)準(zhǔn)品1 mL，用0.22 μm濾膜過后，采用HPLC法測(cè)定。以有機(jī)酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

發(fā)酵液中葡萄糖、乙醇和有機(jī)酸含量的測(cè)定：取發(fā)酵液1 mL稀釋100倍，13 000 r/min離心10 min，取上清液，0.22 μm濾膜過濾，采用HPLC法測(cè)定。

（2）游離氨基酸

參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。利用JMP（Version 9.0.2）軟件進(jìn)行方差分析及多重比較。采用Sigmaplot（Version 10.0）軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母QY-1的生長及pH值變化分析

圖1 釀酒酵母QY-1的生長狀況及pH值變化Fig.1 Growth situation and pH change of Saccharomyces cerevisiae QY-1

由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，OD600nm值呈先急速上升后保持穩(wěn)定的趨勢(shì)。在發(fā)酵0～24 h期間，釀酒酵母QY-1生長迅速；發(fā)酵24 h時(shí)，OD600nm值達(dá)到1.125±0.034；發(fā)酵24 h后，釀酒酵母QY-1生長進(jìn)入穩(wěn)定期。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，pH值與OD600nm值負(fù)向耦合，呈先急速下降后保持穩(wěn)定的趨勢(shì)。在發(fā)酵0～24 h期間，pH值急速下降；發(fā)酵24 h時(shí)，pH值為3.87±0.08；發(fā)酵24 h后，pH值趨于穩(wěn)定；發(fā)酵72 h時(shí)，pH值為3.81±0.04。因此得出，釀酒酵母QY-1在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，促使發(fā)酵體系的pH值降低。

2.2 葡萄糖和乙醇含量變化分析

圖2 釀酒酵母QY-1發(fā)酵過程中葡萄糖和乙醇含量的變化Fig.2 Changes of glucose and ethanol content during Saccharomyces cerevisiae QY-1 fermentation

由圖2可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，葡萄糖被不斷消耗，發(fā)酵54 h時(shí)，葡萄糖被消耗殆盡。而乙醇的生成量與葡萄糖消耗量負(fù)向耦合，呈先急速上升后略有下降最后保持平穩(wěn)的趨勢(shì)，在發(fā)酵36 h時(shí)，乙醇含量最高，為（26.87±2.76）g/L。分析原因可能是，酵母菌在發(fā)酵過程中將α-酮戊二酸、丙酮酸和乳酸逐漸轉(zhuǎn)化為乙醇代謝中間產(chǎn)物，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，乙醇產(chǎn)量迅速提高。在發(fā)酵后期，由于營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，酵母菌生長代謝活性降低，導(dǎo)致乙醇含量逐漸穩(wěn)定。袁文杰等[18]利用HPLC法研究克魯維酵母（Kluyveromyces）菊芋發(fā)酵液中乙醇、糖和有機(jī)酸的變化情況發(fā)現(xiàn)，主要發(fā)酵產(chǎn)物為乙醇，主要副產(chǎn)物為乙酸、甘油和琥珀酸。

2.3 釀酒酵母QY-1發(fā)酵過程中有機(jī)酸及游離氨基酸變化分析

由圖3可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，有機(jī)酸含量呈現(xiàn)先升高后保持平穩(wěn)的趨勢(shì)，在發(fā)酵72 h時(shí)達(dá)到最高，為（3.242±0.213）g/L。而游離氨基酸含量則呈先升高后降低的趨勢(shì)，在發(fā)酵24 h時(shí)達(dá)到最高，為（5.57±0.08）mg/L，此時(shí)有機(jī)酸含量為（2.364±0.101）g/L。在發(fā)酵72 h時(shí)，游離氨基酸含量為（3.68±0.11）mg/L，分析原因可能是發(fā)酵過程中菌體消耗了氨基酸[19]。酸類物質(zhì)是酒精飲料中重要的風(fēng)味物質(zhì)，在酒精飲料中有增加濃厚感和減少甜味的作用，但是酸含量要適中，否則會(huì)影響酒精飲料的口感和風(fēng)味[20]。游離氨基酸是酵母發(fā)酵過程中的主要可同化含氮物，對(duì)酵母菌的生長、碳源消耗和防止發(fā)酵停滯等均有重要影響[21]。在發(fā)酵食品以及酒精飲料中添加酵母菌，不僅可以有效地改善食品飲料的風(fēng)味和口感，還可以提高食品飲料的營養(yǎng)價(jià)值。

圖3 釀酒酵母QY-1發(fā)酵過程中有機(jī)酸及游離氨基酸總量的變化Fig.3 Changes of total organic acid and total free amino acid contents during Saccharomyces cerevisiae QY-1 fermentation

為進(jìn)一步研究釀酒酵母QY-1的發(fā)酵動(dòng)態(tài)變化，對(duì)菌株發(fā)酵過程中有機(jī)酸及游離氨基酸的種類及含量進(jìn)行分析，結(jié)果見表1及表2。

表1 釀酒酵母QY-1發(fā)酵過程中有機(jī)酸種類及含量的變化Table 1 Changes of types and contents of organic acid during Saccharomyces cerevisiae QY-1 fermentation g/L

由表1可知，在釀酒酵母QY-1的整個(gè)發(fā)酵過程中，共檢測(cè)到6種有機(jī)酸，包括檸檬酸、α-酮戊二酸、丙酮酸、琥珀酸、L-乳酸和乙酸，沒有檢測(cè)到蘋果酸和甲酸。發(fā)酵12 h時(shí)，乙酸含量最高為（0.599±0.021）g/L，其次為丙酮酸（0.399±0.010）g/L；發(fā)酵24 h之后，檸檬酸和L-乳酸消失，各有機(jī)酸的含量從高到低依次為乙酸、丙酮酸、琥珀酸、α-酮戊二酸。檸檬酸是三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生的少量中間代謝產(chǎn)物，很少甚至沒有被分泌到胞外，甚至有少量的檸檬酸會(huì)被酵母菌利用[16]，因此，在發(fā)酵24 h時(shí)消失。

由表2可知，在釀酒酵母QY-1發(fā)酵過程中，共檢測(cè)到17種游離氨基酸，谷氨酸含量最高，其次為甘氨酸，天冬氨酸、胱氨酸和蛋氨酸的含量較少。氨基酸作為營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)指標(biāo)，不僅可以促進(jìn)人體機(jī)體正常生長、修復(fù)組織、調(diào)節(jié)血糖，而且可以提供能量，對(duì)人體的健康起著重要作用。釀酒酵母QY-1發(fā)酵過程中包含人體所需的8種必需氨基酸，因此可以得出，釀酒酵母QY-1所產(chǎn)生的氨基酸種類齊全、營養(yǎng)豐富，可以應(yīng)用于多種食品和飲料中，提高營養(yǎng)價(jià)值。

表2 釀酒酵母QY-1發(fā)酵過程中游離氨基酸種類及含量的變化Table 2 Changes of types and contents of free amino acid during Saccharomyces cerevisiae QY-1 fermentation mg/L

3 結(jié)論

本研究對(duì)釀酒酵母QY-1發(fā)酵過程中的OD600nm值、pH值、葡萄糖消耗量、乙醇生成量、有機(jī)酸及游離氨基酸種類及含量進(jìn)行監(jiān)控和分析。結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，釀酒酵母QY-1的OD600nm值呈現(xiàn)先升高后保持穩(wěn)定趨勢(shì)，pH值呈現(xiàn)先急速下降后保持平穩(wěn)的趨勢(shì)，pH值與OD600nm值呈負(fù)向耦合；乙醇的生成量與葡萄糖消耗量負(fù)向耦合；有機(jī)酸含量呈現(xiàn)先升高后保持平穩(wěn)的趨勢(shì)，最高達(dá)（3.242±0.213）g/L，其中乙酸含量最高，其次為丙酮酸。游離氨基酸含量則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，最高達(dá)（3.68±0.11）mg/L，其中谷氨酸含量最高，蛋氨酸含量最低。本研究結(jié)果不僅為篩選用于食品工業(yè)和釀酒工業(yè)的優(yōu)勢(shì)菌株提供菌株來源，還為釀酒酵母的代謝過程研究提供理論支撐，同時(shí)為釀酒酵母功能性食品的開發(fā)和應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。