牛紅紅，苗欣宇，李 達(dá)，遲燕平，劉佳彤，鄭 麗，蘇 穎，王景會(huì)

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，吉林 長(zhǎng)春 130033）

納豆是黃豆經(jīng)納豆菌發(fā)酵而成的豆制品。納豆菌別稱納豆芽孢桿菌（Bacillus natto），屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）納豆菌亞種[1-2]，是一種對(duì)人體非常有益的可食用益生菌。納豆菌在發(fā)酵納豆的過(guò)程中產(chǎn)生多種酶，在酶的作用下，黃豆不易被人體消化吸收的脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物等大分子物質(zhì)，被轉(zhuǎn)化為更易被人體吸收的小分子營(yíng)養(yǎng)成分，如氨基酸、有機(jī)酸、寡聚糖等[1-3]；同時(shí)產(chǎn)生納豆特有的活性成分，納豆激酶（nattokinase，NK）是一種絲氨酸蛋白酶，因具有治療心血管疾病、預(yù)防骨質(zhì)疏松等多種保健功而效備受關(guān)注[4-5]。發(fā)酵合格的納豆表面有一層黏液，挑起時(shí)呈拉絲狀，具有納豆特殊的香味[6-7]。納豆黏液含有大量活性物質(zhì)如NK、血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制劑、多糖等，具有抗腫瘤、溶栓、降壓、抗氧化等多種保健功能[8]，是評(píng)價(jià)納豆品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)[9]。

納豆菌影響納豆品質(zhì)，NK活力、黏液營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此篩選發(fā)酵性能好的納豆菌至關(guān)重要。國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者以NK活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，開展了納豆菌篩選和培育研究。KWON E Y等[10]首先通過(guò)纖溶活性篩選，再通過(guò)16S rRNA技術(shù)鑒定枯草芽孢；劉夢(mèng)潔等[1]則將纖溶活性篩選和納豆激酶基因鑒定相結(jié)合，可準(zhǔn)確篩選到NK高產(chǎn)菌株；張杰等[11]利用超聲波和紫外線對(duì)納豆菌進(jìn)行復(fù)合誘變處理，篩選出NK高產(chǎn)突變菌株；LEE B H等[12]對(duì)比分析了4株枯草芽孢桿菌對(duì)納豆的發(fā)酵效果。關(guān)于納豆黏液成分組成，已開展了相關(guān)研究[13-14]，但是關(guān)于不同菌株對(duì)NK活力、納豆黏液各營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)的影響，尚鮮見報(bào)道。

本研究以實(shí)驗(yàn)室前期從不同地區(qū)、不同稻草中已經(jīng)分離篩選的具有較好發(fā)酵性能的5株納豆菌為出發(fā)菌株，進(jìn)行納豆發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，通過(guò)比較分析NK活力、納豆黏液中的營(yíng)養(yǎng)，評(píng)價(jià)不同菌株發(fā)酵性能，以期為納豆生產(chǎn)用菌篩選提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與材料

5株納豆菌（編號(hào)分別為JLTH-075、JLGZL-018、JLTH-157、JLCC-243、JLLY-214）：吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所食品微生物團(tuán)隊(duì)保藏（分離菌株樣品分別來(lái)源于吉林省通化、公主嶺、通化、長(zhǎng)春、遼源地區(qū)的稻草；5株菌產(chǎn)地、水稻品種不相同）；黃豆（小粒豆，吉林省通化市）：市售。

1.1.2 化學(xué)試劑

牛凝血酶（2000U/mg）、牛纖維蛋白原（純度＞85%）：沈陽(yáng)拜英生物技術(shù)有限公司；注射用尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品（1000IU/mg）：武漢人福藥業(yè)有限責(zé)任公司；瓊脂糖（分析純）：法國(guó)Biowest公司。酵母浸粉、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

改良LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉3 g/L、氯化鈉10 g/L、葡萄糖3 g/L，pH 6.0～6.5，121 ℃高壓滅菌20 min。

改良LB固體培養(yǎng)基：改良LB液體培養(yǎng)基添加16 g/L瓊脂粉。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋：日本Sanyo公司；3K15冷凍離心機(jī)：美國(guó)Sigma公司；Cary300紫外可見光分光光度計(jì)：美國(guó)Varian公司；2300 k凱氏定氮儀：丹麥FOSS公司；S433D全自動(dòng)氨基酸分析儀：德國(guó)Sykam公司；HZQ-X100全溫振蕩培養(yǎng)箱、DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；DL-CJ-2ND型超級(jí)潔凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化及發(fā)酵液制備

菌種活化：將甘油管保藏的5株不同菌株，接種量2%，接入裝有50 mL改良LB培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，37 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)18 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：取4 mL活化好的菌液轉(zhuǎn)接于裝有200 mL LB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)4 h即為發(fā)酵液。

1.3.2 納豆加工工藝流程

黃豆（精選去除雜物）→浸泡（12 h）→蒸煮及滅菌（100 ℃、2 h）→冷卻至室溫→接菌（接菌量4%）→發(fā)酵（37 ℃、18 h）→后熟（4 ℃冰箱，18 h）

1.3.3 分析檢測(cè)

（1）納豆黏液產(chǎn)率計(jì)算

參照劉晶等[15]的測(cè)定方法，稍作改動(dòng)。

（2）納豆黏液成分測(cè)定

納豆黏液待測(cè)樣品制備：取100.00 g納豆，用100 mL生理鹽水，將納豆表面黏液全部清洗轉(zhuǎn)移至離心管中。分別測(cè)定納豆黏液中水分（直接干燥法[16]）、可溶性總糖（苯酚-濃硫酸法[17]）、總蛋白含量（凱氏定氮法[18]）、水解氨基酸及游離氨基酸（全自動(dòng)氨基酸分析儀[19]，水解氨基酸用HCl水解法，游離氨基酸用磺基水楊酸法，儀器條件相同）。

（3）發(fā)酵液納豆活菌數(shù)的測(cè)定

采用稀釋平板法測(cè)定發(fā)酵液納豆活菌數(shù)[20]，稍作改動(dòng)。改良LB平板，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)12 h，統(tǒng)計(jì)單菌落個(gè)數(shù)，計(jì)算納豆活菌數(shù)，控制發(fā)酵種子液活菌數(shù)在1.0×108～3.0×108CFU/g之間，以保持5株菌種發(fā)酵液活力一致。

1.3.4 納豆激酶活性的測(cè)定

納豆激酶活測(cè)定：參照瓊脂糖-纖維蛋白平板法測(cè)定納豆激酶活性[21]，并作改進(jìn)。

尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：用生理鹽水將注射用尿激酶，分別配制成2 000 IU/mL、1 000 IU/mL、800 IU/mL、500 IU/mL、250 IU/mL尿激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，以尿激酶酶活對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)（x），尿激酶溶圈面積為縱坐標(biāo)（y），繪制尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=0.223 5x+2.066 5，相關(guān)系數(shù)R2為0.997。

納豆激酶酶活定義：在37 ℃、1 min內(nèi)水解纖維蛋白產(chǎn)生0.01 mm2透明圈的所需酶量為1個(gè)酶活單位（IU）[21]。

納豆樣品測(cè)定：納豆研磨均勻，取5.00 g，加入生理鹽水50 mL，37 ℃、180 r/min振蕩提取30 min，14 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液，其余與尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線方法相同。由尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出被測(cè)樣品的納豆激酶酶活力。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及制圖，SPSS 17.0軟件中單因素方差方法，用Duncan多重比較對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)分析，以P＜0.05為差異顯著，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式來(lái)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌種發(fā)酵納豆黏液產(chǎn)率及活菌數(shù)

不同納豆菌所產(chǎn)納豆中黏液產(chǎn)率及活菌數(shù)分析結(jié)果見表1。

表1 不同納豆菌發(fā)酵納豆黏液產(chǎn)率及活菌數(shù)Table 1 Yield and viable count of natto mucus fermented by different Bacillus natto

由于實(shí)驗(yàn)采用同一種黃豆，接菌量及生產(chǎn)工藝相同，所以含水量相同[6]。在含水量相同的情況下，黏液產(chǎn)率不同，是由于發(fā)酵菌株不同造成的。因?yàn)榧{豆黏液是納豆菌從黃豆成分中降解、合成的，其產(chǎn)率和納豆菌數(shù)量及分泌各種酶的能力有關(guān)。納豆菌數(shù)量多、活性則高產(chǎn)酶能力強(qiáng)，黏液產(chǎn)率高，納豆感官濕潤(rùn)、口感酥軟，品質(zhì)較優(yōu)。

由表1可知，納豆黏液的產(chǎn)率與所接的納豆菌種有關(guān)。5株菌種中，菌株JLGZL-018納豆黏液產(chǎn)率最高為（20.17±1.72）%，并與其他4株差異顯著（P＜0.05）。5株菌發(fā)酵的納豆活菌數(shù)在5.45×108～1.30×109CFU/g之間。其中，菌株JLTH-075、JLGZL-018、JLTH-157納豆樣品活菌數(shù)較多，均＞109CFU/g。因?yàn)榧{豆菌本身具有溶栓、降壓、抗炎等保健功能，所以活菌數(shù)是判定納豆品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[7]。5株納豆菌由于來(lái)源不同，自身活性及生長(zhǎng)性能不一致，所以在相同發(fā)酵條件下，活菌數(shù)也不同。其中菌株JLGZL-018，活菌數(shù)較多為1.23×109CFU/g，且黏液產(chǎn)率也最高，同時(shí)其他4株納豆菌也表現(xiàn)出黏液產(chǎn)率與活菌數(shù)量呈正相關(guān)。

2.2 納豆激酶活力檢測(cè)結(jié)果

由于NK是納豆生產(chǎn)過(guò)程中特有的一種酶，具有很強(qiáng)的溶栓效果，并且口服安全性高，是判定納豆產(chǎn)品品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)[7]。不同菌株發(fā)酵的納豆中所含NK的活性測(cè)定結(jié)果見圖1。

圖1 不同菌種對(duì)納豆激酶活性的影響Fig.1 Effect of different strains on nattokinase activity

由圖1可知，5株納豆菌發(fā)酵，NK活性在2086～4167IU/g之間，其中菌株JLGZL-018納豆樣品的激酶活性顯著高于其他菌株發(fā)酵納豆（P＜0.05），為4 167 IU/g。NK是納豆菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的一種蛋白酶，5株菌來(lái)源不同，其產(chǎn)生NK活力不同。同時(shí)從NK活力結(jié)果來(lái)看，活菌數(shù)、黏液產(chǎn)率較高的JLGZL-018菌株對(duì)應(yīng)的NK活性較高，反之亦然，說(shuō)明了NK活力與活菌數(shù)相關(guān)。已報(bào)道的商業(yè)化納豆產(chǎn)品中NK活力范圍一般在800～4 000 IU/g[22]，而菌株JLGZL-018生產(chǎn)的NK活力高于商業(yè)化NK活力水平，具有應(yīng)用前景。

2.3 不同菌種發(fā)酵納豆對(duì)其黏液的影響

2.3.1 不同菌種發(fā)酵納豆對(duì)其黏液總蛋白含量影響

黃豆的蛋白質(zhì)含量豐富，用黃豆發(fā)酵而成的納豆，蛋白含量幾乎與牛肉相當(dāng)[6]。5種納豆菌發(fā)酵納豆黏液總蛋白含量測(cè)定結(jié)果見圖2。

圖2 不同菌種對(duì)納豆黏液性蛋白質(zhì)含量影響Fig.2 Effect of different strains on protein contents in natto mucus

由圖2可知，菌株JLGZL-018發(fā)酵納豆黏液中總蛋白含量最高，達(dá)到（17.38±0.54）%，并與其他4株納豆黏液差異顯著（P＜0.05）；JLLY-214和JLTH-157納豆黏液蛋白含量分別為（13.68±0.20）%、（13.86±0.28）%，兩者之間差異不顯著（P＞0.05）；菌株JLCC-243和JLTH-075黏液總蛋白含量較低，分別為（9.57±0.38）%和（9.66±0.77）%，與其他3株菌黏液蛋白含量差異顯著（P＜0.05）。納豆黏液中的總蛋白是由納豆菌產(chǎn)生的豐富蛋白酶對(duì)黃豆蛋白分解產(chǎn)生的多肽、氨基酸等分子質(zhì)量較小的含氮化合物，該類化合物有利于NK合成，提高納豆的品質(zhì)。由于5株菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的蛋白酶種類或者活性不同，所以納豆黏液中總蛋白存在差異。同時(shí)5株菌黏液蛋白含量高低與其對(duì)應(yīng)的活菌數(shù)、NK活力趨勢(shì)基本一致。從黏液蛋白含量來(lái)看菌株JLGZL-018生產(chǎn)的納豆黏液中蛋白總量豐富、品質(zhì)較高。

2.3.2 不同菌種對(duì)納豆黏液可溶性總糖含量影響

5種納豆菌發(fā)酵納豆黏液可溶性總糖含量測(cè)定結(jié)果見圖3。

納豆黏液中的可溶性總糖是納豆菌產(chǎn)生的淀粉酶、糖化酶等分解黃豆中化合物生成的。黏液中的總糖含量高，則黏液產(chǎn)率較高、納豆細(xì)膩綿軟，營(yíng)養(yǎng)成分更易被吸收利用，納豆品質(zhì)好。由圖3可知，5株生產(chǎn)的菌納豆黏液中可溶性總糖不相同，菌株JLGZL-018納豆黏液中可溶性總糖含量最高，為（5.21±0.13）%。并且在黏液產(chǎn)率、NK活力方面也均優(yōu)于其他菌株，進(jìn)一步說(shuō)明該菌株活力好，分泌的酶能更好的把黃豆中的大分子碳水化合物降解、合成為黏液中的小分子可溶性總糖，其生產(chǎn)的納豆?fàn)I養(yǎng)價(jià)值較高。

圖3 不同菌種對(duì)納豆黏液可溶性總糖量影響Fig.3 Effect of different strains on total soluble sugar contents in natto mucus

2.3.3 不同菌種對(duì)納豆黏液菌株水解氨基酸含量影響

黏液中氨基酸主要來(lái)源于納豆菌生產(chǎn)的蛋白酶對(duì)大豆蛋白的分解產(chǎn)物[23]。納豆中總氨基酸含量是判斷納豆發(fā)酵是否成功一個(gè)重要指標(biāo)，也是納豆苦氨味的來(lái)源，黏液中含有大量氨基酸，所以分析其總氨基酸含量顯得十分重要[6]。不同納豆菌發(fā)酵納豆黏液水解氨基酸含量測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 不同菌種對(duì)納豆黏液水解氨基酸含量影響Table 2 Effect of different strains on hydrolyzed amino acids contents in natto mucus g/100 g

由表2可知，納豆黏液中水解氨基酸含量豐富，16種氨基酸總量為（4.80±0.50）～（5.42±0.40）g/100 g，5株菌氨基酸總量之間差異不顯著（P＞0.05），菌株JLTH-157含量最高為（5.42±0.40）g/100 g，可能會(huì)產(chǎn)生較重的納豆苦氨味，JLGZL-018菌株氨基酸總量適中，為（5.34±0.27）g/100 g，7種人體必需氨基酸最高為（0.87±0.08）g/100 g，其中蛋氨酸和賴氨酸這兩種限制性氨基酸，含量最高分別為（0.03±0.01）g/100 g和（0.20±0.01）g/100 g，說(shuō)明該菌株生產(chǎn)的納豆?fàn)I養(yǎng)成分更理想。谷氨酸不但是重要的呈味物質(zhì)，也是納豆黏液拉絲重要組成部分γ-多聚谷氨酸的合成前體，谷氨酸含量高，納豆黏液豐富、拉絲好、納豆風(fēng)味濃郁[13-14]。5株不同菌種發(fā)酵的納豆黏液中谷氨酸含量為（0.51±0.15）～（0.64±0.17）g/100 g，之間差異不顯著（P＞0.05），以菌株JLTH-157含量最高為（0.64±0.17）g/100 g優(yōu)于其他菌株。綜合水解氨基酸各指標(biāo)來(lái)看，菌株JLGZL-018最具優(yōu)勢(shì)，尤其是限制性氨基酸含量豐富。

2.3.4 不同菌種對(duì)納豆黏液游離氨基酸含量影響

研究表明，黃豆在發(fā)酵過(guò)程中，黃豆蛋白在微生物的作用下被分解成水溶性氮化物，其中游離氨基酸占水溶性氮化合物的10%[24]。因?yàn)橛坞x氨基酸易被降解為對(duì)人體有害的生物胺[5，25]，并且其含量與納豆風(fēng)味呈負(fù)相關(guān)，納豆產(chǎn)品中應(yīng)控制游離氨基酸含量在適當(dāng)?shù)姆秶?，是納豆發(fā)酵工藝和產(chǎn)品質(zhì)量控制的關(guān)鍵指標(biāo)。不同菌種發(fā)酵納豆黏液游離氨基酸的含量測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 不同菌種對(duì)納豆黏液游離氨基酸含量影響Table 3 Effect of different strains on free amino acid contents in natto mucus mg/g

由表3可知，從游離氨基酸種類及含量來(lái)看，5株菌差異不明顯。納豆黏液中游離氨基酸，總量為（3.10±0.09）～（3.36±0.10）mg/g，差異不顯著（P＞0.05），菌株JLGZL-018游離氨基酸總量最高為（3.36±0.10）mg/g；7種人體必需氨基酸總量為（1.83±0.05）～（2.02±0.19）mg/g，差異不顯著（P＞0.05），菌株JLTH-157含量最高為（2.02±0.19）mg/g；5株菌納豆黏液中谷氨酸含量為（0.11±0.03）～（0.12±0.02）mg/g，差異不顯著（P＞0.05），菌株JLGZL-018、JLTH-157、JLCC-243、JLLY-214谷氨酸含量最高為（0.12±0.02）mg/g。結(jié)果表明，5株菌之間各有特點(diǎn)，性能差別不是很大。

3 結(jié)論

綜上所述，菌種來(lái)源不同，生產(chǎn)的納豆NK活力和黏液營(yíng)養(yǎng)成分各方面有所差異。其中菌株JLGZL-018生產(chǎn)的納豆NK活力最高為4 167 IU/g，屬于NK高產(chǎn)菌株。黏液產(chǎn)率最高為（22.66±2.61）%；黏液中總蛋白、可溶性糖，含量最高分別為（17.38±0.54）%、（4.80±0.50）%；黏液中水解氨基酸中的必需氨基酸、限制性蛋氨酸、賴氨酸含量分別為（0.87±0.08）g/100 g、（0.03±0.00）g/100 g和（0.20±0.01）g/100 g均高于其他4株菌；在與納豆風(fēng)味呈負(fù)相關(guān)的游離氨基酸含量方面，與其他菌株差別不明顯。綜合來(lái)看，JLGZL-018菌株無(wú)論是在NK活力實(shí)驗(yàn)，還是黏液營(yíng)養(yǎng)成分方面均具有明顯優(yōu)勢(shì)，而且發(fā)酵性能較好，具有開發(fā)應(yīng)用潛力，本研究可為高品質(zhì)納豆生產(chǎn)用菌篩選提供依據(jù)。