覃 引，熊音如，盧 麗，邊 疆，張群英

（1.貴州理工學(xué)院 食品藥品制造工程學(xué)院，貴州 貴陽 550003；2.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州貴山紅農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，貴州 貴陽 550018）

酵素是通過益生菌發(fā)酵一種或多種新鮮蔬菜、水果、菌菇、中草藥等而成的一種功能性液體或固體，因富含酶、維生素、微量元素、氨基酸和多酚等營養(yǎng)物質(zhì)，受到國內(nèi)外研究者的重視，具有極大的發(fā)展?jié)摿1]。近年來，水果酵素的制備與抗氧化活性研究逐漸成為熱點(diǎn)，水果酵素具有較強(qiáng)的抗氧化能力，對(duì)人體內(nèi)的自由基有清除作用[2]。林冰等[3]利用自然發(fā)酵的方式制備刺梨酵素，并研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中刺梨酵素有較好的抗氧化活性；張巧等[4]采用自然發(fā)酵的方式制備大果山楂酵素，并研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵至15～25 d時(shí)，大果山楂酵素抗氧化能力最強(qiáng)；李世燕等[5]以毛酸漿為原料，采用不同發(fā)酵工藝制備酵素，并對(duì)酵素發(fā)酵過程中的抗氧化活性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)酵工藝制得毛酸漿酵素均有較強(qiáng)的抗氧化性。

樹莓（Rubus idaeus）及石榴（Punica granatum）富含多酚類化合物，具有較強(qiáng)的抗氧化能力[6]。嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）具有減輕乳糖不耐受癥、預(yù)防胃炎和感染性腹瀉等作用[7]。干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）具有降低膽固醇的作用[8-9]。

因此，本實(shí)驗(yàn)以樹莓和石榴復(fù)合果汁為原料，采用自然發(fā)酵、單一添加嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、單一添加干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）及同時(shí)添加嗜熱鏈球菌和干酪乳桿菌發(fā)酵四種方式制備酵素，并對(duì)其發(fā)酵過程中的pH值、總酚含量、總黃酮含量、羥自由基（·OH）清除能力、超氧離子自由基（O2-·）清除率及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力進(jìn)行測(cè)定，以期確定合適的制備工藝，為樹莓、石榴等水果的加工開發(fā)提供理論依據(jù)，提高樹莓、石榴的附加值并利于當(dāng)?shù)剞r(nóng)產(chǎn)品加工發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

樹莓：貴州貴山紅農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司；石榴：貴州水城縣南亞生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.1.2 菌株

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，ST）、干酪乳桿菌亞種（Lactobacillus casei，LC）：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 試劑

DPPH（分析純）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；福林酚（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；MRS培養(yǎng)基：上海博微生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV5500型紫外-可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；HH-4D數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司；SHZF-4263臺(tái)式氣浴全溫振蕩培養(yǎng)箱：成都瑞昌儀器制造有限公司；JB-CJ-2FXS潔凈工作臺(tái)：無錫優(yōu)派科技有限公司；GR60DA立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器：致徽（廈門）儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化與擴(kuò)培

挑取適量的嗜熱鏈球菌凍干粉、干酪乳桿菌凍干粉分別接種至5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h，按接種量2%（V/V）分別接種至100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)36～48 h，待用。

1.3.2 樹莓-石榴復(fù)合果汁的制備

參考程勇杰等[10]的方法稍作修改：用無菌水洗滌生果，然后用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇進(jìn)行表面消毒，再用無菌水沖洗。將樹莓、石榴與無菌水按質(zhì)量比0.5∶0.5∶1.0混合，粉碎成漿液，裝至1 000 mL錐形瓶中，在37 ℃、180 r/min條件下振蕩3 h。四層紗布過濾漿液得到澄清的樹莓-石榴復(fù)合果汁，用無菌水稀釋2倍后分裝至250 mL錐形瓶各100 mL。

1.3.3 樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素的制備

參考李豆[11]的方法稍作修改：向樹莓-石榴復(fù)合果汁中分別加入1%嗜熱鏈球菌，1%干酪乳桿菌，0.5%嗜熱鏈球菌和0.5%干酪乳桿菌，37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)96 h。每12 h取樣，4 500 r/min離心10 min，取上清液。以自然發(fā)酵制備的樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素為對(duì)照，測(cè)定不同發(fā)酵方式制備的樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素發(fā)酵過程中pH值、總酚含量、總黃酮含量及抗氧化活性的變化。

1.3.4 測(cè)定方法

pH值：采用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

總酚含量：參照文獻(xiàn)[12]的方法。以沒食子酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，建立沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，對(duì)總酚含量進(jìn)行計(jì)算。

總黃酮含量：參照文獻(xiàn)[13]的方法。以蘆丁質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，建立蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，對(duì)總黃酮含量進(jìn)行計(jì)算。

羥自由基清除率：參照文獻(xiàn)[14]的方法測(cè)定樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素對(duì)羥自由基的清除能力。

DPPH自由基清除率：參考文獻(xiàn)[15]的方法測(cè)定樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素對(duì)DPPH自由基的清除能力。

超氧陰離子自由基清除率：參考文獻(xiàn)[16-17]的方法并稍作修改。向1 mL樣品中加入3 mL Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.2），混勻，加入0.2 mL鄰苯三酚（2.5 mmol/L），混勻，反應(yīng)4 min，再加入10 mol/L HCl 2滴終止反應(yīng)，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)320 nm處的吸光度值（A）。鄰苯三酚（2.5 mmol/L）自氧化4 min，測(cè)定波長(zhǎng)320 nm處的吸光度值（A0）。以Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.2）作為空白對(duì)照，重復(fù)3次試驗(yàn)。計(jì)算超氧陰離子清除率，其計(jì)算公式如下：

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用OriginPro9.0軟件繪圖，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，使用SPSS25.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素發(fā)酵過程中pH值的變化

不同發(fā)酵方式制備的樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素發(fā)酵過程中pH值的變化見圖1。

圖1 樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素發(fā)酵過程中pH值的變化Fig.1 Change of pH during the fermentation of Rubus idaeus-Punica granatum compound juice enzyme

由圖1可知，4種發(fā)酵方式制備的樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素發(fā)酵過程中pH值的變化趨勢(shì)一致，在發(fā)酵0～12 h時(shí)，pH值上升；發(fā)酵12～24 h時(shí)，pH急速下降；發(fā)酵24～60 h時(shí)，pH值緩慢下降。發(fā)酵12 h后pH值不斷降低，主要是因?yàn)殡S著糖的消耗，發(fā)酵液中有機(jī)酸的不斷生成使pH值降低，其次在微生物生長(zhǎng)和代謝過程中利用果汁中的糖類產(chǎn)生大量CO2，一部分CO2溶于發(fā)酵液中也有可能導(dǎo)致pH值降低；同時(shí)生成的CO2使得瓶?jī)?nèi)充滿氣泡，導(dǎo)致pH值有波動(dòng)。當(dāng)發(fā)酵96 h后，pH值趨于穩(wěn)定，分析原因可能是由于pH值過低會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)，最終pH值降至3.52。結(jié)果表明，較低的pH值利于發(fā)酵進(jìn)行。

2.2 樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素發(fā)酵過程中總酚含量的變化

以沒食子酸的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，建立沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2。由圖2可知，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=47.757x-0.015 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1，說明線性關(guān)系良好，可用于總酚含量的測(cè)定。

圖2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of gallic acid

不同發(fā)酵方式制備的樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素發(fā)酵過程中總酚含量的變化見圖3。

圖3 樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素發(fā)酵過程中總酚含量的變化Fig.3 Change of total phenols contents during the fermentation of Rubus idaeus-Punica granatum compound juice enzyme

由圖3可知，樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素在發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，總酚含量先增加后降低。除自然發(fā)酵外，其他3種發(fā)酵方式發(fā)酵72 h時(shí)，總酚含量均達(dá)到最大，其中混菌發(fā)酵方式的總酚含量最高，為0.57 mg/mL，因此，混菌發(fā)酵方式最好。總酚含量呈先增加后降低的原因可能是在發(fā)酵前期，微生物將大分子酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)變成小分子酚類[18]，也可能由于發(fā)酵微生物對(duì)多酚復(fù)合物的酶促降解[19]，導(dǎo)致總酚含量增加。發(fā)酵過程中微生物可能代謝產(chǎn)生CO2和水，使發(fā)酵液濃度降低，從而使后期總酚含量下降[20]。

2.3 樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素發(fā)酵過程中總黃酮含量的變化

以蘆丁質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，建立蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖4。由圖4可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=1.314 9x+0.028 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1，線性關(guān)系良好，可用于總黃酮含量的測(cè)定。

圖4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of rutin

不同發(fā)酵方式制備的樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素發(fā)酵過程中總黃酮含量的變化見圖5。

圖5 樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素發(fā)酵過程中總黃酮含量的變化Fig.5 Change of the total flavonoids contents during the fermentation of Rubus idaeus-Punica granatum compound juice enzyme

由圖5可知，4種發(fā)酵方式制備的樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素發(fā)酵過程中總黃酮含量的變化趨勢(shì)一致，均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。采用混菌和干酪乳桿菌發(fā)酵60 h時(shí)，總黃酮含量達(dá)到最高，分別為0.41 mg/g、0.36 mg/g。采用嗜熱鏈球菌和自然發(fā)酵72 h時(shí)，總黃酮含量達(dá)到最高，分別為0.33 mg/g、0.27 mg/g。結(jié)果表明，混菌發(fā)酵方式最好。發(fā)酵過程中總黃酮含量的增加可能是微生物產(chǎn)生的某種酶類使黃酮苷水解成黃酮苷元導(dǎo)致總黃酮含量增加。后期由于pH值的不斷降低，黃酮苷元的溶解度逐漸減小最終從溶液中析出，導(dǎo)致黃酮類化合物含量降低。也有可能是因?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)后，黃酮本身被水解所致[21]。

2.4 樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素抗氧化活性研究

2.4.1 樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素發(fā)酵過程中羥自由基清除率的變化

不同發(fā)酵方式制備的樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素發(fā)酵過程中羥自由基清除率的變化見圖6。

圖6 樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素發(fā)酵過程中羥基自由基清除率的變化Fig.6 Change of hydroxyl radical scavenging rate during the fermentation of Rubus idaeus-Punica granatum compound juice enzyme

由圖6可知，除自然發(fā)酵方式外，其余3種發(fā)酵方式酵素的羥自由基清除能力隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，呈上升下降交替變化的波動(dòng)趨勢(shì)。采用混菌和干酪乳桿菌發(fā)酵72 h時(shí)，羥自由基清除率達(dá)到最大，分別為67.1%、48.5%，而采用嗜熱鏈球菌發(fā)酵60 h時(shí)，羥自由基清除率達(dá)到最大，為41.9%。有研究表明，微生物在代謝過程中會(huì)產(chǎn)生一些胞外清除自由基的活性物質(zhì)（如胞外多糖等）能提高羥基自由基的清除率[22-23]。發(fā)酵后期羥基自由基清除率降低可能原因是溫度較高影響發(fā)酵液的穩(wěn)定性所致。結(jié)果表明，混菌發(fā)酵方式最好。

2.4.2 樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率的變化

不同發(fā)酵方式制備的樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率的變化見圖7。

由圖7可知，采用嗜熱鏈球菌與混菌發(fā)酵時(shí)，DPPH自由基清除率先增加后降低，60 h時(shí)達(dá)到最高，分別為79%、94%；采用干酪乳桿菌發(fā)酵0～60 h時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，DPPH自由基清除率呈上升趨勢(shì)，但略有波動(dòng)，在60 h時(shí)達(dá)到最高（69%）后迅速下降，后趨于平穩(wěn)；自然發(fā)酵過程中，DPPH自由基清除率緩慢上升后趨于平穩(wěn)。有研究表明，乳桿菌能使黃酮轉(zhuǎn)化為游離的黃酮苷元，而游離態(tài)的苷元抗氧化能力更強(qiáng)，這有可能是DPPH自由基清除率提高的原因之一[24-25]。

圖7 發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率的變化Fig.7 Change of DPPH radical scavenging rate during the fermentation of Rubus idaeus-Punica granatum compound juice enzyme

2.4.3 樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素發(fā)酵過程中超氧陰離子清除活性的變化

不同發(fā)酵方式制備的樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素發(fā)酵過程中超氧陰離子清除率的變化見圖8。

圖8 發(fā)酵過程中超氧陰離子自由基清除率的變化Fig.8 Changes of superoxide anion radical scavenging rate during the fermentation of Rubus idaeus-Punica granatum compound juice enzyme

由圖8可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，4種發(fā)酵方式制備的樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素的超氧陰離子自由基清除率均呈先升高后緩慢降低的趨勢(shì)，且采用混菌方式發(fā)酵72 h時(shí)，超氧陰離子自由基清除率最高為54%，表明混菌發(fā)酵方式最好。

3 結(jié)論

與單一嗜熱鏈球菌發(fā)酵、單一干酪乳桿菌發(fā)酵、自然發(fā)酵相比，嗜熱鏈球菌和干酪乳桿菌混菌發(fā)酵方式最優(yōu)，能增加樹莓-石榴復(fù)合果汁酵素中總酚含量、總黃酮含量，提高抗氧化能力?；炀l(fā)酵72 h時(shí)，總酚含量（0.57 mg/mL）、·OH清除率（67%）及O2-·清除率（54%）最高；發(fā)酵60 h時(shí)，總黃酮含量（0.41 mg/g）及DPPH自由基清除率（94%）最高；發(fā)酵過程中，pH值最低，且變化最小，利于發(fā)酵的進(jìn)行。