李 斌，胡俊杰，張?zhí)m蘭，李紹亮，李學(xué)思，郭書(shū)賢

（1.南陽(yáng)理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473004；2.河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽(yáng) 473004；3.河南省宋河酒業(yè)股份有限公司，河南 鹿邑 477265）

在我國(guó)常采用大曲、小曲和麩曲生產(chǎn)白酒，固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)白酒方法中，大曲既是一種粗制酶制劑，又是一種糖化發(fā)酵劑，同時(shí)也起生香作用[1]。由于大曲是自然培養(yǎng)而成的，所以含有霉菌、酵母、細(xì)菌等多種微生物種群及其產(chǎn)生的蛋白酶酶系、淀粉酶酶系及風(fēng)味酶酶系等復(fù)合酶系，是一種多菌種的混合酶制劑，為形成復(fù)雜的香氣成分起重要作用，由此可見(jiàn)，曲的優(yōu)劣與酒的質(zhì)量和酒體風(fēng)格直接相關(guān)，名酒之所以為名酒，名在質(zhì)量，貴在風(fēng)格。微生物在白酒釀造中起著主要作用，因此了解微生物在酒曲培養(yǎng)以及白酒釀造過(guò)程中的習(xí)性和作用，不僅有利于提高白酒質(zhì)量，而且可滿足消費(fèi)者對(duì)于曲酒類(lèi)型的不同需求以及對(duì)曲酒品質(zhì)的要求[2]。

傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）等技術(shù)只能對(duì)大曲中少數(shù)可以分離培養(yǎng)的菌種進(jìn)行研究，具有很大的局限性，而高通量測(cè)序（high-throughput sequencing，HTS）技術(shù)具有高通量、高分辨率的優(yōu)勢(shì)，為準(zhǔn)確揭示微生物菌群的多樣性提供了強(qiáng)有力的手段，能夠充分展示微生物菌群的多樣性[3]。目前，Rocher 454、Illumina和Iontorrent是廣泛應(yīng)用的高通量測(cè)序平臺(tái)，Miseq是Illumina開(kāi)發(fā)的第二代高通量測(cè)序技術(shù)，具有成本低、準(zhǔn)確率高、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛且成功地應(yīng)用于食品[4]、土壤[5-6]、水資源[7-8]等的微生物菌群分析，但目前應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)白酒釀造大曲的真菌的研究報(bào)道還比較少。

本實(shí)驗(yàn)采用高通量測(cè)序技術(shù)，利用Illumina公司Miseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)濃香型白酒的中高溫曲和芝麻香型白酒的高溫曲中的真菌多樣性進(jìn)行研究，建立一套高通量測(cè)序技術(shù)分析白酒酒曲真菌的方法，同時(shí)通過(guò)數(shù)據(jù)分析，完整的解析兩種酒曲中真菌的群落結(jié)構(gòu)。為建立濃香型白酒酒曲和芝麻香型白酒酒曲的微生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，優(yōu)化酒曲的發(fā)酵工藝和提升品質(zhì)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

濃香型白酒中高溫曲（1月齡、2月齡、4月齡，分別命名為Z1、Z2、Z3）、芝麻香型白酒高溫曲（命名為AA1）：均取自河南省宋河酒業(yè)股份有限公司。樣品采集后迅速粉碎密封，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

Taq脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（5 U/μL）：美國(guó)Thermo公司；E.Z.N.A.Soil DNA提取試劑盒：美國(guó)OMEGA公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒：美國(guó)Life公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mastercycler PCR儀：德國(guó)Eppendorf公司；Pico-21臺(tái)式離心機(jī)：美國(guó)Thermo Fisher公司；GL-88B漩渦混合器：其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器：拓能達(dá)科技有限公司；DYY-6C型電泳儀：北京六一儀器廠；GelDoc-ItTS3凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)UVP公司；Miseq高通量測(cè)序儀：美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

酒曲中微生物總DNA的提取按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)中的方法和步驟進(jìn)行。

1.3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及測(cè)序

以總DNA為模板，采用Miseq測(cè)序平臺(tái)的通用引物ITS1（5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN（barcode）CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2-Rev（5'-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）對(duì)酒曲中真菌的ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增體系：10×PCR buffer 5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）0.1 mmol/L，DNA 10 ng，ITS1 0.5 μmol/L，ITS2-Rev 0.5 μmol/L，PlantiumTaq0.05 U，用雙蒸水補(bǔ)充至50 μL。

PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，共計(jì)5個(gè)循環(huán)；然后94 ℃變性20 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，共計(jì)20個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

PCR擴(kuò)增結(jié)束后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，利用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。利用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行精確定量，依托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測(cè)序。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序獲取的原始序列的雙末端序列融合成一個(gè)方向的序列并進(jìn)行質(zhì)量控制（quality control，QC），方法如下：

（1）序列的融合，采用1.2.3 Flash軟件融合雙末端的序列，通過(guò)各個(gè)樣品的barcode使數(shù)據(jù)回歸樣品，并對(duì)各個(gè)樣品序列進(jìn)行質(zhì)量控制。

（2）QC分析：采用V0.20.4 Prinseq軟件對(duì)序列閱讀框的3'端進(jìn)行質(zhì)控，去掉堿基質(zhì)量（Q）值＜20的數(shù)據(jù)，提高后續(xù)序列的融合比率；通過(guò)Flash軟件融合雙末端序列，使其形成一條序列；采用Prinseq軟件去除各個(gè)樣品的引物序列、小于200 bp的序列、低質(zhì)量序列和低復(fù)雜度序列；截掉非靶區(qū)域序列和嵌合體，首先采用1.30.1 Mothur軟件的Pre.cluster模塊校正測(cè)序錯(cuò)誤，校正過(guò)程中允許的最大錯(cuò)配是1/150。然后，以Silva數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列作為模板，采用Uchime功能模塊去掉嵌合體和非靶區(qū)域序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列的拼接

采用Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)得到Z1、Z2、Z3、AA1樣本對(duì)應(yīng)的原始序列分別為49 404條、51 278條、64 658條和98 202條，其平均長(zhǎng)度分別為317.72 bp、304.71 bp、296.31 bp和254.15 bp，經(jīng)拼接、過(guò)濾，分別得到有效序列49 389條、51 246條、64 587條和97 934條，其平均長(zhǎng)度分別為273.91 bp、261.13 bp、252.28 bp和211.03 bp。

2.2 序列豐富度和多樣性分析

香農(nóng)（Shannon）指數(shù)、ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)、辛普森（Simpson）指數(shù)和Coverage指數(shù)是常用于描述微生物群落物種多樣性的Alpha多樣性指數(shù)，這5個(gè)多樣性指數(shù)可以對(duì)群落物種組成的豐富度及群落物種組成的均勻度進(jìn)行綜合性的評(píng)價(jià)，5個(gè)多樣性指數(shù)中的Shannon指數(shù)對(duì)微生物群落物種多樣性更為敏感。其中，Shannon指數(shù)越大，群落物種的多樣性越高；Chaol指數(shù)或ACE指數(shù)越大表明群落物種豐富度越高；由Coverage指數(shù)可知本次實(shí)驗(yàn)的取樣是否合理，若Coverage指數(shù)＞97%，則證明本次取樣是合理的；但Simpson指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越低[9]。基于高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)濃香型白酒中高溫曲和芝麻香型白酒高溫曲中真菌的序列數(shù)量、操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTU）和Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行研究，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同酒曲中真菌的序列數(shù)量、操作分類(lèi)單元和Alpha多樣性指數(shù)分析結(jié)果Table 1 Analysis results of sequence amounts,operational taxonomic units and alpha diversity indexes of fungi in different Jiuqu

由表1可知，盡管Z1、Z2、Z3、AA1樣品對(duì)應(yīng)的Alpha指數(shù)在絕對(duì)數(shù)值上略有差異，但都可以看出測(cè)序數(shù)據(jù)量已足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。通過(guò)對(duì)4個(gè)樣本對(duì)比分析可知，在濃香型白酒中高溫曲中，樣品Z3的Chao1指數(shù)值（668.43）最大，說(shuō)明Z3樣本的真菌群落物種豐富度最高；樣品Z2的Shannon指數(shù)值（1.42）最大且Simpson指數(shù)值（0.36）最小，說(shuō)明樣品Z2的真菌群落多樣性最高。芝麻香型白酒高溫曲樣本AA1的Chao1指數(shù)值（764.45）和Shannon指數(shù)值（2.65）都比濃香型白酒中高溫曲的指數(shù)值大，因此，芝麻香型高溫曲的真菌物種豐富度和真菌群落多樣性都比濃香型白酒中高溫曲的大。4個(gè)樣品的Coverage指數(shù)都＞97%，說(shuō)明本次取樣是合理的，測(cè)序結(jié)果能反映樣本的真實(shí)情況。

2.3 香農(nóng)指數(shù)曲線分析

香農(nóng)指數(shù)曲線反映樣品中微生物多樣性，可以用于比較測(cè)序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度，也可以用于說(shuō)明樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理。當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU，反之則表明繼續(xù)測(cè)序還可能產(chǎn)生較多新的OTU[10]。

基于高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)濃香型白酒中高溫曲和芝麻香型白酒高溫曲中真菌的香農(nóng)指數(shù)進(jìn)行分析，香農(nóng)指數(shù)曲線如圖1所示。

由圖1可以看出，隨著測(cè)定序列數(shù)量的增加，稀釋曲線趨向平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，取樣情況能較好的說(shuō)明樣品中涵蓋的所有菌群，樣品Z1、Z2和Z3的稀疏性曲線幾乎在同一曲線上，這是由于3個(gè)樣本的Shannon指數(shù)值（分別為1.38、1.42和1.34）非常接近，所以微生物群落物種的多樣性幾乎是一樣的，更多的數(shù)據(jù)量對(duì)發(fā)現(xiàn)新OTU的邊際貢獻(xiàn)很小。而樣品AA1的稀疏性曲線則高于樣品Z1、Z2和Z3，說(shuō)明在芝麻香型白酒曲中真菌的物種多樣性高于濃香型白酒中高溫曲中真菌的物種多樣性。

圖1 不同酒曲的香農(nóng)指數(shù)曲線Fig.1 Shannon index curves of different Jiuqu

2.4 基于屬水平各樣本中真菌的種類(lèi)和相對(duì)豐度分析

在屬水平上，基于高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)濃香型白酒中高溫曲和芝麻香型白酒高溫曲真菌的種類(lèi)和相對(duì)豐度進(jìn)行分析，根據(jù)相對(duì)豐度將樣本中菌屬分為優(yōu)勢(shì)菌屬（相對(duì)豐度≥1.0%）和次要菌屬（相對(duì)豐度＜1.0%），且將次要菌屬歸類(lèi)于其他（others），其結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同酒曲中真菌菌屬及相對(duì)豐度Table 2 Genus and relative abundance of fungi in different Jiuqu

由表2可知，假絲酵母屬（Candida）是濃香型白酒中高溫曲和芝麻香型白酒高溫曲中的優(yōu)勢(shì)真菌群。隨著濃香型白酒中高溫曲貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，Candida的相對(duì)豐度逐漸增加。而曲霉屬（Aspergillus）則正好相反，貯存時(shí)間越長(zhǎng)菌屬相對(duì)豐度越低。除此之外，根毛霉屬（Rhizomucor）的相對(duì)豐度是先上升再下降，說(shuō)明這類(lèi)菌屬在貯存4個(gè)月過(guò)程會(huì)出現(xiàn)峰值，然后開(kāi)始下降；熱子囊菌屬（Thermoascus）則是先下降再上升。在濃香型白酒1月齡、2月齡和4月齡的中高溫曲中未分類(lèi)酵母的含量依次遞減，到4月齡的酒曲中未分類(lèi)酵母只占0.57%。芝麻香型白酒高溫曲中真菌的物種多樣性高于濃香型白酒曲中真菌的物種多樣性，其主要優(yōu)勢(shì)菌屬是假絲酵母（Candida）、曲霉屬（Aspergillus）、威克漢姆酵母（Wickerhamomyces）、根毛菌屬（Rhizomucor）等。

參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道分析以上8種優(yōu)勢(shì)真菌菌屬的功能作用如下：

假絲酵母（Candida）屬于半知菌亞門(mén)（Deuteromycotina）、芽孢菌綱（Blastomycetes）、隱球酵母目（Cryptococcales）、隱球酵母科（Cryptacoccaceae），此屬中有許多種具有酒精發(fā)酵的能力。施安輝等[11]研究發(fā)現(xiàn)，徐坊中高溫大曲中耐熱的Candida在酵母菌種中占優(yōu)勢(shì)；呂旭聰?shù)萚12]研究發(fā)現(xiàn)，福建紅曲黃酒中含有10株光滑假絲酵母（Candida glabrata）。

曲霉屬（Aspergillus）屬半知菌亞門(mén)（Deuteromycotina）、絲孢綱（Hyphomycetes）、絲孢目（Hyphomycetes）、從梗孢科（Moniliaceae）[13]，能夠產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、酯化酶、果膠酶、纖維素酶、單寧酶等，在白酒的釀造過(guò)程中主要作用于發(fā)酵的前期，是白酒發(fā)酵原料中淀粉等大分子物質(zhì)分解的主要?jiǎng)恿χ籟14]。

根毛霉屬（Rhizomucor）屬于接合菌門(mén)（Zygomycota）、接合菌綱（Zygomycetes）、毛霉目（Mucorales）、毛霉科（Mucoraceae）。高亦豹[15]采用PCR-DGGE技術(shù)發(fā)現(xiàn)米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）僅存在于今世緣中溫曲、口子窖中溫曲、湯溝大曲及劍南春大曲等中溫大曲中。該菌具有很強(qiáng)的產(chǎn)脂肪酶能力，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者對(duì)該菌所產(chǎn)脂肪酶進(jìn)行了研究[16]。

嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）屬于真菌門(mén)（Eumycota）、子囊菌亞門(mén)（Ascomycotina）、嗜熱子囊菌科（Thermoascaceae），可以產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶[17]、內(nèi)切葡聚糖酶[18]、木聚糖酶[19]、葡萄糖苷酶[20]、角質(zhì)酶[21]和幾丁質(zhì)酶[22]等。徐占成等[8]利用高通量測(cè)序法對(duì)劍南春大曲真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Thermoascus在檢測(cè)大曲樣品中的相對(duì)豐度值介于1.711%～5.081%之間。

威克漢姆酵母（Wickerhamomyces）屬于非釀酒酵母，雖然其發(fā)酵能力較低，但其可以合成多種酶，將原料中的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化成酯、酸、高級(jí)醇和醛等風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)白酒風(fēng)味的形成有重要的作用[23]。明紅梅等[24]利用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）發(fā)酵產(chǎn)苯乙醇的條件；陳玉香等[25]研究了發(fā)酵溫度對(duì)W.anomalus產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響。

脈孢菌屬（Neurospora）屬于子囊菌亞門(mén)（Ascomycotina）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）、糞殼菌目（Sordariales），糞殼菌科（Sordariaceae），主要產(chǎn)生纖維素酶[26]，其模式菌粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）在纖維素降解以及糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白方面取得了極其顯著的成就[27-29]。

炭疽菌屬（Colletotrichum）又稱(chēng)刺盤(pán)孢屬，是半知菌亞門(mén)（Deuteromycotina）、腔孢綱（Coelomycetes）、黑盤(pán)孢目（Melanconiales）、黑盤(pán)孢科（Melanconiaceae）[30]。炭疽菌是一種植物病原真菌[31-32]，也是一種植物內(nèi)生真菌，普遍存在各種植物中，可以增強(qiáng)植物對(duì)病蟲(chóng)害的抵抗能力或者產(chǎn)生特有的次生代謝產(chǎn)物[33]。

鐮刀菌屬（Fusarium）是全球最重要的大型真菌屬之一，主要侵染農(nóng)業(yè)上重要的谷物[34]，產(chǎn)生的鐮刀菌屬真菌毒素具有急性和慢性毒性作用[35]，在酒曲的生產(chǎn)中要注意防治。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于Illumina MiSeq高通量測(cè)序研究了宋河酒業(yè)濃香型白酒中高溫酒曲和芝麻香型白酒高溫酒曲中的真菌群落結(jié)構(gòu)。在屬的分類(lèi)水平上分析，濃香型白酒中高溫酒曲的優(yōu)勢(shì)真菌群（相對(duì)豐度≥1%）主要有假絲酵母（Candida）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、根毛霉屬（Rhizomucor）等。芝麻香型白酒高溫酒曲的優(yōu)勢(shì)真菌群主要有假絲酵母（Candida）、曲霉屬（Aspergillus）、威克漢姆酵母（Wickerhamomyces）等。隨著濃香型白酒中高溫酒曲貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，假絲酵母（Candida）的相對(duì)豐度逐漸增加，其在兩種酒曲中都是優(yōu)勢(shì)真菌，此屬中有許多種具有酒精發(fā)酵的能力。采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)酒曲中的菌落物種分類(lèi)研究，操作簡(jiǎn)單、通量高、信息豐富，和傳統(tǒng)方法比較具有一定的優(yōu)越性。該研究成果為進(jìn)一步研究?jī)?yōu)化制曲工藝、提高酒曲質(zhì)量指明了方向，具有重要的理論和實(shí)踐意義。