李昊文 沈宓 李子瑞 張文麗 王宇新 高培毅 王雅杰

缺血性卒中發(fā)病率和致死率高，是世界范圍內(nèi)威脅人類生命健康的重大疾病。動脈粥樣硬化易損斑塊破裂引發(fā)的血栓栓塞是缺血性卒中的主要致病因素。顱外段頸動脈或顱內(nèi)動脈粥樣硬化斑塊均可以導(dǎo)致供血動脈管腔狹窄、血栓形成甚至栓子脫落，從而引發(fā)缺血性卒中[1-2]。組織病理學(xué)研究結(jié)果顯示，易損斑塊的特點(diǎn)包括管腔表面破裂、斑塊內(nèi)出血、附壁血栓等[3-4]。早期準(zhǔn)確識別和評估可能導(dǎo)致缺血事件的易損斑塊對于指導(dǎo)臨床治療及卒中預(yù)防至關(guān)重要。目前迫切需要發(fā)掘有效的生物標(biāo)志物來區(qū)分易損型和穩(wěn)定型動脈粥樣硬化斑塊患者[5]。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide ploymorphism，SNP)指基因組上單個核苷酸變異所形成的遺傳標(biāo)記，人類許多表型差異、對藥物或疾病的易感性均與SNP相關(guān)。全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study，GWAS)在全基因組水平通過對大量樣本進(jìn)行SNP等遺傳標(biāo)記的分型分析，從而尋找與復(fù)雜疾病相關(guān)的遺傳基因。已有多項(xiàng)GWAS發(fā)現(xiàn)了眾多與動脈粥樣硬化、冠狀動脈粥樣硬化性疾病、心肌梗死相關(guān)的SNP位點(diǎn)[6-8]，其中一些位點(diǎn)位于相關(guān)的功能基因內(nèi)部或附近。近年來，研究發(fā)現(xiàn)血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1(platelet endothelial cell adhesion molecule 1，PECAM1)中SNP位點(diǎn)rs1867624、平滑肌蛋白1(leiomodin 1，LMOD1)中SNP位點(diǎn)rs2820315可能與動脈粥樣硬化及主動脈疾病相關(guān)[7]，但其與動脈粥樣硬化斑塊易損程度的研究報道較少。

本研究通過對具有頸動脈斑塊的缺血性卒中患者PECAM1基因SNP位點(diǎn)rs1867624和LMOD1基因SNP位點(diǎn)rs2820315進(jìn)行基因分型，研究PECAM1、MOD1基因多態(tài)性與缺血性卒中患者頸動脈斑塊易損風(fēng)險的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 對象

前瞻性連續(xù)納入自2014年5月至2017年10月期間于北京天壇醫(yī)院就診的具有頸動脈斑塊的缺血性卒中患者270例，其中男212例，女58例；年齡40～85歲，平均(60±9)歲，40～49歲35例，50～59歲85例，60～69歲120例，70～79歲28例，80～85歲2例；伴有高血壓病176例(65.2%)，糖尿病91例(33.7%)，高脂血癥87例(32.2%)，短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)45例(16.7%)，具有卒中史64例(23.7%)，卒中家族史46例(17.0%)，心肌梗死家族史6例(2.2%)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡40～85歲；發(fā)生于6個月內(nèi)；經(jīng)過臨床診斷為前循環(huán)、非心源性缺血性卒中患者；高分辨率MRI顯示具有頸動脈斑塊。缺血性卒中患者的診斷符合1995年全國第四屆腦血管病會議通過的卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。

排除標(biāo)準(zhǔn)：心源性卒中(通過超聲心動檢查及24 h動態(tài)心電監(jiān)測排除)；既往頸動脈手術(shù)或支架置入史；既往頸部放射治療；既往肝、腎病史及肝移植患者。

本研究方案經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(審批號：KY2014-004-04)。所有納入患者已簽訂知情同意書。

1.2 方法

1.2.1資料收集:收集受試者人口統(tǒng)計學(xué)信息(性別、年齡、住址、入組時間等)、卒中危險因素(高血壓病、糖尿病、高脂血癥、既往TIA或卒中史、吸煙史)。常規(guī)體格檢查包括身高、體質(zhì)量、心率、血壓(收縮壓、舒張壓)等，實(shí)驗(yàn)室檢查包括三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、空腹血糖、糖化血紅蛋白等。

高血壓病定義為在未使用降壓藥物的情況下，3次非同日測量收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg[10]。糖尿病定義為未使用降糖藥物情況下，空腹血糖≥7.0 mmol/L[11]。高脂血癥定義為未使用降脂藥物情況下，血清中總膽固醇≥6.2 mmol/L和(或)三酰甘油≥2.3 mmol/L[12]。吸煙史定義為患者目前或過去吸煙，吸煙數(shù)量≥5支/d或吸煙時間≥2年。

1.2.2影像學(xué)檢查方法：使用3.0 T超導(dǎo)MR設(shè)備(型號Trio-Tim，Siemens公司，德國)對納入患者進(jìn)行頸動脈高分辨率MRI檢查。頸動脈3D血管成像序列：(1)三維時間飛躍法MR血管成像序列：軸面掃描，重復(fù)時間(time of repetition,TR)25 ms，回旋時間(time of echo,TE)4 ms，空間分辨率 0.6 mm×0.8 mm×2.0 mm，視野 160 mm×120 mm，掃描時間 2 min。(2)T1加權(quán)可變反轉(zhuǎn)角的三維快速自旋回波序列：冠狀面掃描，TR 800 ms，TE 22 ms，空間分辨率 0.8 mm×0.8 mm×0.8 mm，視野180 mm×170 mm，掃描時間261 s。(3)重T1加磁化準(zhǔn)備快速梯度回波序列：軸面掃描，TR 8.8 ms，TE 5.3 ms，空間分辨率 0.8 mm×0.8 mm×0.8 mm，視野140 mm×140 mm，掃描時間199 s。頸動脈超聲檢查采用日本東芝Aplio 500型彩色多普勒超聲診斷儀。

1.2.3分組：依據(jù)頸動脈高分辨率MRI檢查結(jié)果，按照斑塊性質(zhì)，將納入患者分為易損斑塊組與穩(wěn)定斑塊組。易損斑塊定義為具有斑塊內(nèi)出血和(或)斑塊表面缺陷，如纖維帽破裂、潰瘍或表面血栓[4, 13]。

1.2.4基因型分析：患者入組后3 d內(nèi)，清晨6點(diǎn)至10點(diǎn)空腹抽取外周靜脈血2 ml，使用血液基因組DNA提取系統(tǒng)(天根生化科技有限公司)提取DNA，方法見試劑盒操作說明書。利用TaqMan探針(Thermo Fisher，美國，探針編號：C_155066_10及C_1467677_10)分別對PECAM1 rs1867624 和LMOD1 rs2820315 SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。反應(yīng)體系：DNA模板20 ng，TaqMan SNP Genotyping Assays 0.25 μl，2×TaqMan Genotyping Master Mix(Thermo Fisher)5 μl，補(bǔ)水至10 μl。7 500 Fast Real-Time PCR system(Applied Biosystems，美國)儀器進(jìn)行基因型檢測，反應(yīng)條件如下：95 ℃ 10 min預(yù)變性；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，重復(fù)40個循環(huán)。每個SNP位點(diǎn)每種基因型各取2個樣本利用測序的方法進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)方法分型失敗的樣本利用測序的方法進(jìn)行分型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 基本資料比較

270例患者中，189例具有易損斑塊，81例具有穩(wěn)定斑塊。穩(wěn)定斑塊組及易損斑塊組的患者基本臨床資料比較見表1。兩組患者平均年齡、舒張壓差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),其他如體質(zhì)量指數(shù)、收縮壓、高血壓病、糖尿病、高脂血癥、TIA史、卒中史、吸煙史、實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)(三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、空腹血糖、糖化血紅蛋白等)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

2.2 PECAM1基因rs1867624位點(diǎn)及LMOD1基因rs2820315位點(diǎn)多態(tài)性與斑塊易損性關(guān)系

穩(wěn)定斑塊組和易損斑塊組患者中，rs1867624和rs2820315位點(diǎn)的基因頻率和基因型分布比例均達(dá)到Hardy-Weinberg平衡(均P>0.05)。

對PECAM1基因rs1867624位點(diǎn)的多態(tài)性分析顯示，T/T基因型在易損斑塊組患者中所占比例更高，C/C基因型在穩(wěn)定斑塊組患者中所占比例更高。等位基因T是易損性斑塊風(fēng)險基因，其基因頻率在易損斑塊組中為87.3%(330/378)，在穩(wěn)定斑塊組中為79.6%(129/162)。風(fēng)險等位基因OR值為1.759(95%CI：1.080～2.864，P=0.022)，見表2。對LMOD1基因SNP位點(diǎn)rs2820315的分析顯示，C/C基因型在易損斑塊組患者中占更高比例，T/T基因型在穩(wěn)定斑塊組患者中占更高比例。等位基因C是易損性斑塊的風(fēng)險基因，其基因頻率在易損斑塊組中為87.6%(331/378)，在穩(wěn)定斑塊組中為80.9%(131/162)，其OR值為1.667(95%CI：1.014～2.738，P=0.042)，見表3。

將單因素分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義的年齡、舒張壓與PECAM1基因rs1867624位點(diǎn)和LMOD1基因rs2820315位點(diǎn)風(fēng)險基因型納入二分類Logistic回歸分析中，結(jié)果表明，年齡、rs1867624位點(diǎn)T/T基因型及rs2820315位點(diǎn)C/C基因型是易損斑塊發(fā)生的危險因素(均P<0.05)，見表4。

3 討論

近年來，多項(xiàng)GWAS通過高通量測序和DNA微陣列技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了數(shù)十個甚至上百個與動脈粥樣硬化、冠狀動脈疾病、主動脈疾病相關(guān)的基因多態(tài)性位點(diǎn)[6-8]。多項(xiàng)獨(dú)立試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，其中一些基因的多態(tài)性與動脈粥樣硬化高度相關(guān)，如CDKN2A/2B、ADAMTS7、PHACTR1、SH2B3、COL4A1/2等[6,14-17]。然而，GWAS數(shù)據(jù)通常有較高的假陽性，并且多項(xiàng)GWAS是基于歐洲人群，基于亞洲人群的研究相對較少。由于人種間基因構(gòu)成的差異，一些在歐洲人群中發(fā)現(xiàn)的動脈粥樣硬化易感位點(diǎn)在中國人群中無法直接應(yīng)用，如東亞人群中9p21.3、SORT1、PDGFD的OR值均小于歐洲人群[6]。因此，在使用來自歐洲人群的GWAS數(shù)據(jù)前，我們首先需要在中國人群中進(jìn)行廣泛驗(yàn)證。

表1 兩組具有頸動脈斑塊的缺血性卒中患者一般資料及臨床資料比較

組別例數(shù)TIA史卒中史吸煙例(%)三酰甘油[M(P25,P75),mmol/L]膽固醇LDL-CHDL-Cx-±s,mmol/L空腹血糖[M(P25,P75),mmol/L]A組8138(46.9)12(14.8)17(21.0)1.21(0.92,1.95)3.9±1.22.4±1.01.0±0.35.55(4.79,7.53)B組18987(46.0)33(17.5)47(24.9)1.51(0.85,1.94)3.8±0.92.2±0.81.0±0.35.30(4.61,6.33)檢驗(yàn)值0.018a0.286a0.472a-0.474c0.469b0.958b-0.132b-0.678cP值0.894a0.593a0.492a-0.635a0.641a0.341a-0.895a-0.497a

注：A組為穩(wěn)定斑塊組，B組為易損斑塊組；TIA為短暫性腦缺血發(fā)作，LDL-C為低密度脂蛋白膽固醇，HDL-C為高密度脂蛋白膽固醇；a為χ2值，b為t值，c為Z值

表2 具有頸動脈斑塊的缺血性卒中患者PECAM1 rs1867624基因多態(tài)性與斑塊易損性關(guān)系

注：PECAM1為血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1，MAF為最小等位基因頻率

表3 具有頸動脈斑塊的缺血性卒中患者LMOD1 rs2820315基因多態(tài)性與斑塊易損性關(guān)系

注：LMOD1為平滑肌蛋白1，MAF為最小等位基因頻率

表4 具有頸動脈斑塊的缺血性卒中患者易損斑塊風(fēng)險因素的二分類Logistic回歸分析結(jié)果

2017年，研究人員通過基因芯片及Meta分析，發(fā)現(xiàn)了15個與冠狀動脈疾病相關(guān)的基因多態(tài)性新位點(diǎn)，這些位點(diǎn)位于與動脈粥樣硬化及主動脈疾病相關(guān)的功能基因附近，如細(xì)胞黏附、白細(xì)胞遷移和動脈粥樣硬化相關(guān)的PECAM1基因、與凝血和炎性反應(yīng)相關(guān)的PROCR基因、與血管平滑肌細(xì)胞分化相關(guān)的LMOD1基因等[7]。PECAM1參與維持血管壁屏障的完整性，血管壁屏障功能損傷可導(dǎo)致動脈粥樣硬化等慢性炎性疾病的發(fā)生[18]。研究結(jié)果證明，表達(dá)PECAM1的內(nèi)皮細(xì)胞血管壁屏障完整性恢復(fù)更快[19]，此外，PECAM1表達(dá)能夠增加小鼠動脈粥樣硬化易感區(qū)域斑塊負(fù)載并減小主動脈的動脈粥樣硬化區(qū)域[20-21]。因此，PECAM1作為一種候選基因與主動脈疾病的發(fā)生密切相關(guān)。LMOD1在動脈血管壁等富含平滑肌的組織中高度表達(dá)[22]，敲除LMOD1基因會導(dǎo)致主動脈平滑肌細(xì)胞增殖及遷移能力加強(qiáng)、收縮能力受損。研究結(jié)果顯示，LMOD1在維持平滑肌分化狀態(tài)中起關(guān)鍵作用[23]。LMOD1基因多態(tài)性變化可能導(dǎo)致該基因在平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)或功能紊亂，從而提高主動脈疾病的遺傳風(fēng)險。

rs1867624 SNP位點(diǎn)位于PECAM1基因上游，rs2820315 SNP位點(diǎn)位于LMOD1基因內(nèi)含子區(qū)域。該兩個基因多態(tài)性位點(diǎn)均處于基因的非編碼區(qū)域，關(guān)于其引起動脈粥樣硬化斑塊易損性變化的機(jī)制尚不明確。推測其可能影響基因表達(dá)水平，或者僅作為與疾病關(guān)聯(lián)表達(dá)的遺傳位點(diǎn)。本研究通過對具有易損斑塊和穩(wěn)定斑塊的兩組缺血性卒中患者進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)PECAM1基因rs1867624位點(diǎn)T/T基因型，LMOD1基因rs2820315位點(diǎn)C/C基因型在具有易損斑塊的患者中所占比例更高；rs1867624位點(diǎn)C/C基因型，rs2820315位T/T基因型在具有穩(wěn)定斑塊的患者中占更高比例。PECAM1基因SNP位點(diǎn)rs1867624等位基因T、LMOD1基因SNP位點(diǎn)rs2820315等位基因C是形成易損性斑塊的危險基因。進(jìn)一步行多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示， rs1867624位點(diǎn)T/T基因型和rs2820315位點(diǎn)C/C基因型是形成易損性斑塊的風(fēng)險因素，表明PECAM1、LMOD1基因多態(tài)性與缺血性卒中患者頸動脈斑塊易損風(fēng)險相關(guān)，但這些基因多態(tài)性的具體功能和作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

本研究入組6個月內(nèi)發(fā)生缺血性卒中的患者，其中一些患者由于治療，頸動脈斑塊的性質(zhì)可能會發(fā)生逆轉(zhuǎn)(由易損斑塊變成穩(wěn)定斑塊，斑塊體積變小等)。大量臨床研究證實(shí)，他汀類藥物具有調(diào)節(jié)脂代謝、穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊的作用。常規(guī)他汀類藥物治療劑量能起到調(diào)脂、穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊、延緩斑塊進(jìn)展的作用，大劑量他汀類藥物可能使部分患者有機(jī)會發(fā)生斑塊逆轉(zhuǎn)，如應(yīng)用辛伐他汀每天40 mg或阿托伐他汀鈣每天80 mg治療[24-25]。但并不是所有大劑量服用他汀類藥物的患者均能發(fā)生斑塊逆轉(zhuǎn)，不同人的藥物反應(yīng)存在差異。并且，由于大劑量藥物使不良反應(yīng)增加，臨床上很少長時間大劑量使用他汀類藥物。另外，斑塊逆轉(zhuǎn)是一個較為漫長的進(jìn)程，至少會持續(xù)1年以上，相關(guān)臨床研究多在1～3年。因此本研究入組標(biāo)準(zhǔn)6個月內(nèi)，由于治療發(fā)生斑塊逆轉(zhuǎn)的機(jī)會不高，對試驗(yàn)結(jié)果造成的偏倚很小。

本研究的局限性在于：(1)由于動脈粥樣硬化是全身性、系統(tǒng)性疾病，患者腦血管、冠狀動脈、主動脈等也可能存在狹窄和易損斑塊，本研究未對除頸動脈以外的其他部位血管進(jìn)行評價，因此PECAM1、LMOD1基因多態(tài)性與其他部位動脈粥樣硬化斑塊易損性的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。(2)由于入組條件比較嚴(yán)格(患者患有缺血性卒中，具有頸動脈斑塊，且經(jīng)過高分辨MRI及B超檢查)，入組的患者數(shù)量相對較少。大樣本量使我們能夠找到疾病相關(guān)的微效基因，但這些微效基因往往無顯著的臨床意義。在本研究中，由于樣本量較小，更容易尋找到與真實(shí)的臨床疾病相關(guān)性強(qiáng)的關(guān)鍵基因。我們計劃未來繼續(xù)收集臨床患者，豐富試驗(yàn)樣本庫，對研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證和完善，并發(fā)掘更多有意義的與缺血性卒中及動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性相關(guān)的SNP位點(diǎn)。