王曉榮 烏云高娃 趙福全 高玉峰

內蒙古民族大學附屬醫(yī)院1蒙醫(yī)腦血管介入科，2蒙西醫(yī)腎病科（內蒙古通遼028000）

缺血性腦卒中是臨床常見的一種中樞神經系統(tǒng)疾病，具有較高的死亡率和致殘率，嚴重威脅人類的健康和生存質量［1］。其病理生理過程非常復雜，可在多種因素條件下引起腦部血液流動障礙，導致大腦神經元細胞凋亡，會出現(xiàn)動作、語言、感覺和記憶能力等神經功能障礙［2］。在細胞凋亡過程中，磷脂酰肌醇3-激酶∕蛋白激酶B（PI3K∕Akt）信號通路對相關蛋白的調節(jié)發(fā)揮關鍵作用，PI3K∕Akt 可將膜受體信號傳遞至細胞內，來實現(xiàn)維持細胞增殖和抑制細胞凋亡的過程［3］。作為Akt 的底物，糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）是調節(jié)細胞凋亡的關鍵元件［4］。丁基苯酞（butyl phthalide，NBP）是對缺血性腦梗死患者神經功能改善具有顯著效果的藥物，可防止因腦缺血造成腦梗死的發(fā)生，同時有研究［5］表明，NBP 還能改善缺血部位的能量代謝，參與抑制神經細胞的凋亡過程。NBP 通過對PI3K∕Akt∕GSK-3β信號通路的調節(jié)保護局部腦缺血損傷腦梗死的作用機制尚不清楚。本研究采用大鼠大腦中動脈局灶缺血模型，探討NBP 對局部腦缺血損傷腦梗死的保護作用，同時分析其對PI3K∕Akt∕GSK-3β信號通路的調控作用，從而為臨床提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑12 ～15 周齡的SPF 級健康Wistar 雄性大鼠，體質量200 ～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；NBP 購自石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司；LY294002 購自美國Sigma 公司；尼龍線購自上海禾豐制藥有限公司；二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度檢測試劑盒、3，3-二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）化學發(fā)光試劑盒、Akt、P-Akt、GSK-3β、P-GSK-3β抗體均購自上海仁捷生物科技有限公司；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購自美國PALL 公司；磁共振掃描儀購自德國西門子公司；凝膠成像儀購自美國Bio-Rad 公司；BXM-950 光學顯微鏡購自上海炳宇光學儀器有限公司；CM1850石蠟切片機購自北京德泉興業(yè)商貿有限公司；蛋白印跡設備購自美國Bio Rad 公司。

1.2 模型構建和分組處理將100 只12 ～15 周齡的SPF 級Wistar 雄性大鼠隨機分為5 組（n= 20）：假手術組（Sham 組）、模型組（Model 組）、NBP 組、P13K 特異性抑制劑LY294002 組（LY 組）和NBP+LY組。模型構建：大鼠麻醉后，取0.285 mm直徑的尼龍線，參照參考文獻［6］，使大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA）前段及其側支血流阻斷2 h，此時大腦前動脈血流不受影響，造成MCA 局部缺血，待抽回尼龍線，MCA 血流恢復后，完成大鼠大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）造模。Sham組不做血管結扎或阻塞，其余操作同Model 組。造模后第1 天開始，NBP 組、LY 組、NBP+LY 組分別腹腔注射10 mg∕kg NBP、10 mg∕kg LY和10 mg∕kg NBP+10 mg∕kg LY，注射劑量10 μL，每天1 次，連續(xù)給藥7 d，Sham 和Model 組腹腔給予等量生理鹽水。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，批準文號：內蒙古民族大學附屬醫(yī)院醫(yī)倫［2017］第068 號。

1.3 神經功能缺損程度評分（nervous function defect score，NDS）第7 天給藥30 min 后，參考文獻［7］采用改良的mNNS 評分方法，將大鼠行為分為6 個等級，評分標準為：0 分：大鼠爬行正常沒有不對稱活動；1 分：大鼠尾部垂直提起時前肢或后肢彎曲；2 分：大鼠在1 分的基礎上伴有不能直線行走；3 分：大鼠爬行時向左側轉圈；4 分：大鼠自由活動時向左側傾倒；5 分：大鼠在4 分的基礎上出現(xiàn)左前爪后拖；6 分：大鼠肢體完全不能支撐身體，無法自發(fā)爬行。

1.4 磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）法測量腦梗死體積大鼠經神經功能缺損程度評分結束后，隨機選取6 只大鼠，使用磁共振掃描儀檢測腦梗死體積，大鼠取仰臥位，找到標準軸位后，在橫斷面T2-加權成像的基礎上進行冠狀面3 層掃描，層厚度1.5 mm，間距0.2 mm。T2-加權成像檢測大鼠腦梗死體積，梗死區(qū)域為蒼白色，正常腦組織區(qū)域為灰色。利用Image J 分析軟件計算腦梗死體積（%）=（梗死區(qū)體積∕全腦組織體積）×100%。

1.5 尼氏染色檢測腦組織中神經元數(shù)目大鼠經神經功能缺損程度評分結束后，隨機挑取6 只，麻醉后胸腹切口，在露出的心臟左心室插管，4%多聚甲醛心內灌注至整個肝臟變?yōu)榘咨?，取出完整的腦組織至冰器皿上并即刻以4%多聚甲醛固定，再用梯度乙醇在真空條件下脫水二甲苯透明后用石蠟將腦組織包埋處理。處理好的腦組織進行5 μm 厚的冠狀切片參照文獻中的方法進行尼氏染色。光學顯微鏡（×400）下觀察每組切片6 個不同的視野，并通過Image-Pro 6.2 軟件處理圖像，觀察缺血側大腦皮層區(qū)域內完整神經元的數(shù)目。

1.6 免疫印跡法檢測Akt、P-Akt、GSK-3β、PGSK-3β大鼠經神經功能缺損程度評分結束后，隨機挑取6 只，斷頭處死動物，迅速剝離顱骨取缺血側半腦組織在冰浴條件下分離大腦皮質，加入RIPA 組織裂解液中勻漿器打碎，冰浴5 min 后離心，離心條件：13 000 r∕min，4 ℃，時間10 min，獲得上清，BCA 蛋白定量試劑盒進行上清中蛋白濃度的定量檢測，用2×電泳緩沖液稀釋蛋白至相同濃度。10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白，用Tris∕甘氨酸緩沖液將蛋白轉移至PVDF 膜上，5%TBST 液中室溫封閉2 h，將PVDF 膜放入相應一抗稀釋液（均為1∶1 000）中孵育，4 ℃過夜。次日，將膜取出，TBST 液洗滌10 min，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗稀釋液（均為1∶10 000），室溫孵育2 h，加入DAB 發(fā)光液，凝膠成像儀下讀取讀取灰度值，以GAPDH作為內參，計算目的蛋白相對表達水平。

1.7 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)分析采用軟件SPSS 16.0，符合正態(tài)分布的計量資料采用平均數(shù)±標準差進行表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩間比較采用獨立t檢驗，P ＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NBP對MCAO大鼠神經功能的影響與Sham組相比，Model 組大鼠神經功能損傷評分明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（t=-60.335，P ＜0.001），經NBP 治療后，與Model 組相比，NBP 組 神經功能損傷評分出現(xiàn)明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（t=-32.025，P ＜0.001），LY 組、NBP ＋LY 組 與Model 組比較組間差異無統(tǒng)計學意義（t= 1.165，P=0.251；t=0.920，P=0.363）。見圖1。

圖1 NBP 對MCAO 大鼠腦內神經功能的影響Fig.1 Effect of NBP on neural function in MCAO rats

2.2 NBP對MCAO大鼠腦梗死體積的影響Sham組大鼠兩側腦組織未發(fā)現(xiàn)梗死區(qū)域，與Sham 組相比，Model 組腦梗死體積明顯增大（t=-146.485，P ＜0.001）；與Model 組相比，NBP 組腦梗死體積明顯減小，差異具有統(tǒng)計學意義（t=-49.422，P ＜0.001）。LY 組、NBP＋LY 組與Model 組相比組間差異無統(tǒng)計學意義（t=-1.058，P= 0.297；t= 1.758，P=0.087）。見圖2。

圖2 NBP 對MCAO 大鼠腦梗死體積的影響Fig.2 Effect of NBP on cerebral infarction volume in MCAO rats

2.3 NBP 對MCAO 大鼠腦內神經元完整性的影響神經元經過尼氏染色在光鏡下觀察呈藍紫色，如圖3、4 所示，Sham 組神經元形態(tài)正常，與Sham 組相比，Model 組神經元出現(xiàn)異常結構，完整的神經元數(shù)量明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義（t=41.220，P ＜0.001）；與Model 組相比，NBP 組腦組織內完整神經元的數(shù)量明顯升高（t= 28.354，P ＜0.001），LY 組、NBP + LY 組與Model 組相比組間差異無統(tǒng)計學意義（t=-0.4925，P= 0.625；t=0.913，P=0.367）。

圖3 尼氏染色觀察NBP 對MCAO 大鼠腦內神經元完整性的影響（×400）Fig.3 Effect of NBP on neuronal integrity in MCAO rats was observed by Nissl staining（×400）

圖4 各組完整神經細胞個數(shù)比較Fig.4 Comparison of the number of intact neurons among 5 groups

2.4 NBP 對MCAO 大鼠腦組織中Akt、P-Akt、GSK-3β、P-GSK-3β表達的影響為了進一步觀察NBP 對大鼠缺血腦梗死的作用機制，本研究采用蛋白免疫印跡法檢測了缺血區(qū)腦組織中Akt、PAkt、GSK-3β、P-GSK-3β蛋白表達，結果顯示與Sham 組相比，Model 組中Akt、GSK-3β磷酸化水平明顯下降（t= 14.536，P ＜0.001；t= 87.131，P ＜0.001）；與Model 組相比，NBP 組大鼠腦 組 織 中Akt、GSK-3β磷酸化明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（t=-7.830，P ＜0.001；t= 64.879，P ＜0.001），LY 組、NBP ＋LY 組Akt、GSK-3β 磷酸 化水 平與Model 組相比組間差異無統(tǒng)計學意義（P-Akt：t=-0.070，P= 0.944；P-GSK-3β：t= 10.413，P=0.682）；（P-Akt：t= 1.542，P= 0.131；P-GSK-3β：t=1.422，P=0.158）。見圖5。

3 討論

大腦是機體生理功能最為復雜的器官之一，對血液供應具有極強的依賴性，當大腦供血的動脈發(fā)生狹窄或阻斷時，會導致腦組織因供血供氧不足出現(xiàn)局部缺血甚至壞死，大腦功能受到損害，對機體的生理活動產生嚴重不良影響［8-9］。缺血性腦梗死與心血管疾病和惡性腫瘤并列成為對人類生命構成極大威脅的致死性疾病［10］。

對于缺血性腦梗死進行的藥物研發(fā)在醫(yī)學界受到極大重視，NBP 作為缺血性腦血管疾病的治療藥物，在臨床上得到廣泛使用，且效果顯著。本研究采用大鼠腦中動脈阻塞法構建局部腦缺血損傷再灌注模型，Model 組大鼠出現(xiàn)腦梗死體積明顯增大，神經功能缺損嚴重，且神經元細胞凋亡數(shù)目增多。本研究根據(jù)預實驗結果選擇NBP 給藥濃度。結果表明，經過NBP 治療的大鼠與Model 組相比，腦梗死體積明顯縮小，神經功能損傷程度明顯減輕，同時抑制了神經細胞凋亡的數(shù)量，大鼠局部腦缺血損傷得到緩解，該結果與既往實驗結果一致［11］，再次證實了藥物的治療效果。

圖5 NBP 對MCAO 大鼠腦組織中Akt、P-Akt、GSK-3β、P-GSK-3β 表達的影響Fig.5 Effects of NBP on the expression of Akt，P-Akt，GSK-3β and P-GSK-3βgsk-3 in MCAO rats

研究藥物的分子機制，探尋藥物作用的靶點有利于藥物的使用及藥物的優(yōu)化。以往的研究結果表明，線粒體是細胞凋亡的關鍵元件，NBP 可通過提高線粒體三磷酸腺苷（ATP）酶的活性，對因缺血造成損傷的細胞線粒體起到保護作用，從而抑制細胞凋亡［12］。此外研究顯示NBP 可能通過作用于大腦缺血部位，提高位血管內皮生長因子（VEGF）和堿性成纖維生長因子（bFGF）的表達量，實現(xiàn)大腦損傷的保護作用［13］。因研究結果缺少干預實驗進行驗證，對于途徑未進行深入研究。LY294002 作為PI3K 特異性抑制劑，可特異性抑制PI3K110 亞基單元的活性，阻斷PI3K 介導的信號通路。本研究中使用LY294002 驗證NBP 對PI3K∕Akt∕GSK3β信號通路的調節(jié)保護局部腦損傷的作用機制，結果顯示，Akt 和GSK-3β磷酸化水平在NBP 組與Model 組相比大幅增加，而LY+NBP 組較NBP 組下降明顯，LY294002 逆轉了NBP 介導的Akt 和GSK3β磷酸化水平，說明NBP 可通過PI3K來實現(xiàn)Akt 和GSK3β磷酸化進程。有研究［14］表明，PI3K∕Akt∕GSK-3β信號通路抑制了大腦再灌注損傷后細胞的凋亡，同時在后期參與了其修復過程，對于抑制缺血后腦梗死面積擴大起到保護作用。與NBP 組相比，LY+NBP 組大鼠腦梗死體積明顯增大，神經功能損傷程度更為嚴重，且神經細胞凋亡的數(shù)量增加，證明了NBP 可能是通過調控PI3K∕Akt∕GSK-3β信號通路在大腦缺血損傷中起保護作用。

綜上所述，NBP 可以激活缺血性腦梗死所致的PI3K∕Akt∕GSK-3β 信號的激活，從而減輕神經功能損害，發(fā)揮對局部缺血致腦梗死的保護作用。但NBP 是否還能通過調節(jié)其他通路來影響疾病進程，仍需進一步的研究。