白俊艷，樊紅燈，曹 恒，龐有志，宋曉杰，蔣夢(mèng)娟，付學(xué)言，盧小寧，楊 帥，李新月，郝偉光，李子衡，鄭飛揚(yáng)

(河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023)

雌激素受體(estrogen receptor，ESR)是核受體超家族的一員，擁有ESRα和ESRβ兩種亞型，作為媒介來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)雌激素的多向性效應(yīng)。ESRα對(duì)生殖系統(tǒng)(子宮、乳腺)的影響是關(guān)鍵性的，而ESRβ主要影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)，以及腎臟、肺部、骨骼的相關(guān)機(jī)制[1]。Green等[2]首先克隆獲得人的ESRαcDNA序列，長(zhǎng)2 092 bp，可編碼595個(gè)氨基酸。Krust等[3]克隆了雞的ESRα cDNA序列，大小為2 085 bp，能夠?qū)?89個(gè)氨基酸進(jìn)行編碼。Kuiper等[4]和Mosselman等[5]分別進(jìn)行了鼠和人的ESRβ cDNA序列的克隆。Ichikawa等[6]克隆出ESR1基因的cDNA，從此其他一些物種的ESRα和ESRβ的cDNA都漸漸被克隆出來(lái)。Rothschild等[7]研究發(fā)現(xiàn)，ESR基因是影響母豬產(chǎn)仔性狀中起關(guān)鍵作用的一個(gè)基因。豬的ESR1基因與母豬產(chǎn)仔數(shù)存在相關(guān)性[8]。由此可見(jiàn)，ESR基因?qū)π笄莘敝承誀罹哂兄匾挠绊憽?/p>

鵪鶉因體型小、產(chǎn)蛋大而多、飼料消耗少、生長(zhǎng)速度快、培育時(shí)間短、生產(chǎn)成本低、經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn)，具有較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力和發(fā)展前途。鵪鶉蛋中還含有較高的卵磷脂、腦磷脂、維生素和鐵等[9]，鵪鶉肉和蛋對(duì)于哮喘、結(jié)核、代謝障礙以及神經(jīng)衰弱等疾病還具有一定的治療作用，具有比較高的藥用價(jià)值[10]。以上研究表明，ESR基因?qū)π笄莘敝承誀钣幸欢ǖ挠绊懀紤]到基因一般具有一因多效的作用。為此，本實(shí)驗(yàn)以北京白羽鵪鶉、中國(guó)黃羽鵪鶉、朝鮮鵪鶉這3個(gè)鵪鶉品種為研究對(duì)象，采用PCR-RFLP方法分析鵪鶉ESR1基因的遺傳多態(tài)性，并對(duì)鵪鶉蛋品質(zhì)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以探討ESR1基因?qū)g鶉蛋品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所取用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是北京白羽鵪鶉50羽、中國(guó)黃羽鵪鶉50羽、朝鮮鵪鶉50羽，采用心臟采血法進(jìn)行采血，取血后將血液儲(chǔ)存在含有EDTA抗凝劑的真空采血管中，放至-20 ℃的冰箱進(jìn)行冷凍保存以備使用。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA及引物合成

采集鵪鶉心臟血樣，采血后做好標(biāo)記放入-20 ℃冰箱保存。對(duì)血液采用酚/氯仿法提取了基因組DNA，該試驗(yàn)中所使用的引物序列參考蒲躍進(jìn)[11]的方法，ESR1基因外顯子4引物由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司合成，ESR1基因引物信息見(jiàn)表1。

1.2.2 目的片段的PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增反應(yīng)體系為：去離子水5.3 μL，2×TaqPCR Green Mix為7.5 μL，上游引物0.6 μL，下游引物0.6 μL，DNA模板1.0 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

表1 引物序列信息

Table1The information of primer sequence

名稱Name引物序列Primersequence(5′-3′)大小Size/bp退火溫度Annealingtemperature/℃ESR1-E1F:CAAAGCCCTTGGAGTTAC;R:AGCAGTTCTCCCTACTCC37055.4ESR1-E4F:CGGGCGAATGATGAAACA;R:CCCAGTTGATCATGTGCA30158.0ESR1-E8F:CAACAAAGGAATGGAGCA;R:CCCTTCTTTTGCTGTTAA21253.6

1.2.3 PCR-RFLP分析

限制性內(nèi)切酶PvuⅡ?yàn)镋SR1-E1引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系為15 μL：ddH2O 5 μL，PCR產(chǎn)物8 μL，限制性內(nèi)切酶PvuⅡ(10 U·μL-1)0.5 μL，10×buffer 1.5 μL?；旌暇鶆蚝笾糜?7 ℃水浴消化4 h。限制性內(nèi)切酶AccⅠ為ESR1-E8引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系為10 μL：ddH2O 0.5 μL，PCR產(chǎn)物8 μL，限制性內(nèi)切酶PvuⅡ(10 U·μL-1)0.5 μL，10×buffer 1.0 μL?；旌暇鶆蚝笾糜?7 ℃水浴消化4 h。酶切產(chǎn)物使用2.0%濃度的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，跑膠結(jié)束后使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照記錄。

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序及序列的比對(duì)分析

序列比對(duì)主要采用NCBI網(wǎng)站上的BLAST系統(tǒng)對(duì)所測(cè)基因序列進(jìn)行對(duì)比，通過(guò)對(duì)比的結(jié)果來(lái)確認(rèn)該序列是否為目的序列。測(cè)序圖譜用Chromas程序進(jìn)行觀察分析以查找潛在的突變位點(diǎn)，并做記錄統(tǒng)計(jì)。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

多態(tài)信息含量(PIC)、雜合度(He)和有效等位基因數(shù)(Ne)用Dispan軟件計(jì)算。ESR1基因與鵪鶉蛋品質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析統(tǒng)計(jì)模型為

yijk=μ+Pi+Mj+eijk。

(1)

式(1)中：yijk為性狀表型值；μ為總體均值；Pi為品種效應(yīng)(i=1，2，3)；Mj為第j種基因型效應(yīng)；eijk為殘差效應(yīng)；結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵪鶉ESR1基因的PCR產(chǎn)物檢測(cè)

鵪鶉ESR1基因的外顯子1、外顯子4、外顯子8的PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，可以看出檢測(cè)結(jié)果均為單一條帶，ESR1基因的外顯子1、外顯子4、外顯子8與目的片段大小一致，表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量達(dá)標(biāo)效果較好。

2.2 鵪鶉ESR1基因的多態(tài)性檢測(cè)

鵪鶉ESR1基因外顯子1和外顯子8的多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，可以看出外顯子1和外顯子8中均檢測(cè)到3種基因型，ESR1基因外顯子1檢測(cè)到3種基因型分別為T(mén)T基因型(370 bp)、CC基因型(330 bp/40 bp)和CT基因型(434 bp/330 bp/40 bp)。ESR1基因外顯子8檢測(cè)到的3種基因型為T(mén)T基因型(212 bp)、CC基因型(121 bp)和CT基因型(212 bp/121 bp)。

鵪鶉ESR1基因外顯子4的SNP位點(diǎn)測(cè)序峰圖見(jiàn)圖3，可以看出在3個(gè)鵪鶉群體中檢測(cè)到ESR1基因外顯子4有1個(gè)SNP位點(diǎn)為C50T，檢測(cè)到3種基因型即CC、CT和TT基因型。

2.3 鵪鶉群體遺傳多態(tài)性分析

由表2可以看出，ESR1基因外顯子1在3個(gè)鵪鶉群體中均表現(xiàn)為CC基因型頻率最高；ESR1基因外顯子8在3個(gè)鵪鶉群體中均表現(xiàn)為T(mén)T基因型頻率最高；ESR1基因外顯子4在中國(guó)黃羽鵪鶉和朝鮮鵪鶉中均表現(xiàn)為T(mén)T基因型頻率最高，而在北京白羽鵪鶉中則以CC基因型頻率最高。ESR1基因外顯子1、外顯子4、外顯子8在中國(guó)黃羽鵪鶉中的雜合度(0.409、0.491、0.464)、有效等位基因數(shù)(1.690、1.964、1.860)、多態(tài)信息含量(0.326、0.370、0.356)為最高，可見(jiàn)中國(guó)黃羽鵪鶉的遺傳多態(tài)性豐富。

1，中國(guó)黃羽鵪鶉；2，北京白羽鵪鶉；3，朝鮮鵪鶉；M，Marker DL2000。1， Chinese yellow quail; 2， Beijing white quail; 3， Korean quail; M， Marker DL2000.

圖2 鵪鶉ESR1基因的外顯子1(A)和外顯子8(B)的多態(tài)性檢測(cè)

圖3 ESR1基因外顯子4的不同基因型測(cè)序峰圖

表2ESR1基因的基因型頻率和等位基因頻率

Table2Gene genotype frequency and allele frequency ofESR1 gene

ESR基因ESRgene群體Group基因型頻率GenotypefrequencyCCCTTT等位基因頻率AllelefrequencyCT雜合度Hybridization(He)有效等位基因數(shù)Numberofeffectivealleles(Na)多態(tài)信息含量Polymorphicinformationcontent(PIC)外顯子1中國(guó)黃羽鵪鶉0.5150.3970.0880.7130.2870.4091.6900.326Exon1Chineseyellowquail北京白羽鵪鶉0.6000.3860.0140.7930.2070.3281.4800.274Beijingwhitequail朝鮮鵪鶉Koreanquail0.7230.2620.0150.8540.1460.2491.3300.218外顯子4中國(guó)黃羽鵪鶉0.2730.3180.4090.4320.5680.4911.9640.370 Exon4Chineseyellowquail北京白羽鵪鶉0.6670.2350.0980.7840.2160.3391.5120.281Beijingwhitequail朝鮮鵪鶉Koreanquail0.1060.2770.6170.2450.7550.3701.5870.302外顯子8中國(guó)黃羽鵪鶉0.1270.4760.3970.3650.6350.4641.8600.356 Exon8Chineseyellowquail北京白羽鵪鶉0.0440.3380.6180.2130.7870.3351.5000.279Beijingwhitequail朝鮮鵪鶉Koreanquail0.0340.4410.5250.2540.7460.3791.6100.307

2.4 ESR1基因與鵪鶉的蛋品質(zhì)關(guān)聯(lián)分析

由表3可以看出，ESR1基因外顯子4的CC基因型和CT基因型的蛋黃高度和蛋黃指數(shù)要顯著高于TT基因型(P<0.05)。TT基因型的蛋黃寬度要顯著高于CC基因型和CT基因型(P<0.05)。CT基因型和TT基因型的蛋殼厚度要顯著高于CC基因型(P<0.05)。除此之外，ESR1基因外顯子4對(duì)其他蛋品質(zhì)無(wú)顯著影響(P>0.05)。ESR1基因外顯子8在蛋黃指數(shù)上，CC基因型顯著高于CT基因型和TT基因型(P<0.05)，CT基因型和TT基因型之間不存在顯著性差異(P>0.05)。CT基因型和TT基因型的蛋黃寬度顯著高于CC基因型(P<0.05)。除此之外，ESR1基因外顯子8對(duì)其他蛋品質(zhì)無(wú)顯著影響(P>0.05)。ESR1基因外顯子1對(duì)所有蛋品質(zhì)均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表3ESR1基因與鵪鶉蛋品質(zhì)的關(guān)聯(lián)結(jié)果

Table3Association results ofESR1 gene and quail egg quality

性狀TraitsESR1基因外顯子1Exon1ofESR1geneCCCTTTESR4基因外顯子4Exon4ofESR4geneCCCTTTESR8基因外顯子8Exon8ofESR8geneCCCTTT蛋質(zhì)量Eggweight10.520±0.099a10.544±0.133a10.625±0.364a10.511±0.118a10.380±0.129a10.648±0.142a10.257±0.260a10.591±0.124a10.512±0.105a蛋長(zhǎng)端Egglongend31.815±0.153a31.994±0.182a32.255±0.781a31.898±0.207a31.562±0.212a32.085±0.192a31.166±0.42a32.006±0.156a31.873±0.180a蛋短端Eggshortend24.926±0.078a24.856±0.123a24.908±0.235a24.876±0.103a24.809±0.112a24.980±0.110a24.799±0.168a24.925±0.103a24.892±0.083a蛋形指數(shù)Eggshapeindex1.277±0.006a1.288±0.006a1.295±0.028a1.283±0.008a1.273±0.008a1.285±0.006a1.256±0.014a1.285±0.006a1.281±0.007a蛋黃高度Eggyolkheight7.478±0.108a7.453±0.153a7.675±0.320a7.749±0.119a7.514±0.175a7.162±0.141b7.786±0.142a7.402±0.133a7.503±0.125a蛋黃寬度Eggyolkwidth25.367±0.201a25.527±0.257a25.105±0.342a25.027±0.247b25.067±0.299b26.018±0.258a24.267±0.701b25.557±0.253a25.417±0.210a蛋黃指數(shù)Eggyolkindex0.298±0.006a0.295±0.008a0.309±0.025a0.305±0.009a0.303±0.009a0.278±0.007b0.323±0.015a0.293±0.007b0.298±0.006b蛋黃質(zhì)量Eggyolkweight3.459±0.041a3.456±0.053a3.525±0.250a3.417±0.058a3.400±0.055a3.546±0.048a3.357±0.139a3.460±0.050a3.470±0.043a蛋殼厚度Eggshellthickness0.170±0.002a0.172±0.003a0.172±0.003a0.165±0.002b0.173±0.003a0.176±0.003a0.170±0.007a0.169±0.002a0.172±0.002a蛋白高度Proteinheight1.709±0.054a1.537±0.074a1.785±0.359a1.725±0.070a1.671±0.085a1.585±0.072a1.739±0.199a1.711±0.078a1.593±0.054a

同行數(shù)據(jù)后沒(méi)有相同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

The values in the same row with different lower-case letters showed significant differences (P<0.05).

3 討論

3.1 ESR1基因在鵪鶉群體中的多態(tài)性

季華員等[12]研究發(fā)現(xiàn)，ESR1基因在東鄉(xiāng)綠殼蛋雞群體中的外顯子1有5個(gè)突變位點(diǎn)，外顯子4和8各有1個(gè)突變位點(diǎn)。王洪才等[13]研究莊河大骨雞ESR基因發(fā)現(xiàn)了CC、CD和DD這3種基因型。張舒等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在肉鴿中存在兩種ESR基因型AA和AB。本研究中，使用ESR1基因的外顯子1、外顯子4、外顯子8在3個(gè)品種的鵪鶉群體中進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，均檢測(cè)到3種基因型，ESR1基因外顯子4上均有1處SNP突變位點(diǎn)(C50T)，且外顯子4在中國(guó)黃羽鵪鶉、朝鮮鵪鶉兩個(gè)群體的T等位基因頻率均高于C等位基因頻率，等位基因T為該兩個(gè)群體的優(yōu)勢(shì)等位基因。這與蒲躍進(jìn)[11]對(duì)我國(guó)神丹Ⅰ號(hào)鵪鶉的H系、L系及野生鵪鶉3個(gè)群體的ESR1基因C50T位點(diǎn)的研究結(jié)果相似。

3.2 ESR1基因與鵪鶉蛋品質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析

ESR基因與繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析在其他畜禽的研究中報(bào)道較多，如徐小波等[15]研究表明，二花臉豬的ESR基因BB型初產(chǎn)及經(jīng)產(chǎn)總產(chǎn)仔數(shù)(TNB)和產(chǎn)活仔數(shù)(NBA)均高于AB型(P<0.05)和AA型(P<0.01)。唐現(xiàn)文等[16]研究表明，ESR基因在蘇姜豬的3個(gè)世代中BB型基因的第2～4胎總產(chǎn)仔數(shù)顯著高于AA和AB的第2～4胎總產(chǎn)仔數(shù)。于吉英等[17]研究發(fā)現(xiàn)，ESR基因與文昌雞的300日齡的產(chǎn)蛋數(shù)之間存在顯著相關(guān)(P<0.05)，而與文昌雞個(gè)體的連產(chǎn)天數(shù)存在極顯著相關(guān)(P<0.01)。季華員等[12]對(duì)東鄉(xiāng)綠殼蛋雞的ESR1基因的多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，ESR1基因外顯子4的突變位點(diǎn)(C267T)產(chǎn)生的3種基因型與東鄉(xiāng)綠殼蛋雞300日齡的平均產(chǎn)蛋量存在明顯相關(guān)(P<0.05)。王洪才等[13]對(duì)莊河大骨雞的ESR基因的CC基因型的產(chǎn)蛋數(shù)和料蛋比等性狀指標(biāo)顯著高于該位點(diǎn)其他基因型(P<0.05)。陳燕等[18]在對(duì)文昌雞和巴布考克蛋雞研究時(shí)，在2個(gè)群體雞ESRα基因的5′端檢測(cè)到了4個(gè)突變位點(diǎn)(A34G、T76C、T79C、C102T)，但這4個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)雞的產(chǎn)蛋性狀并沒(méi)有顯著影響。涂小璐[19]對(duì)皖西白鵝研究發(fā)現(xiàn)，ESR1基因內(nèi)含子上的A105G突變位點(diǎn)所含有的幾個(gè)基因型與鵝的產(chǎn)蛋量、開(kāi)產(chǎn)蛋重和開(kāi)產(chǎn)體重等產(chǎn)蛋性狀不存在相關(guān)性。謝三磊等[20]研究發(fā)現(xiàn)，ESRβ基因與黑羽鵪鶉的產(chǎn)蛋性能存在一定相關(guān)性。

而ESR基因與家禽蛋品質(zhì)關(guān)聯(lián)分析報(bào)道較少，僅見(jiàn)韋雄等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在長(zhǎng)順綠殼蛋雞群體中ESR1基因外顯子5前有一個(gè)SNP位點(diǎn)-999 bp(上有A、C兩個(gè)等位基因)，該突變位點(diǎn)上的3種基因型(AA、AC、CC)與長(zhǎng)順綠殼蛋雞產(chǎn)蛋的蛋殼厚度存在相關(guān)；蒲躍進(jìn)[11]研究發(fā)現(xiàn)，ESR基因外顯子8與鵪鶉的20周蛋質(zhì)量之間存在相關(guān)(P<0.05)。本研究表明，ESR1基因外顯子4和外顯子8主要對(duì)蛋黃高度、蛋黃寬度、蛋黃指數(shù)、蛋殼厚度有顯著影響(P<0.05)，這一結(jié)果與蒲躍進(jìn)[11]、韋雄等[21]的研究結(jié)果相似。因此，推測(cè)ESR1基因可能為蛋用鵪鶉的蛋品質(zhì)相關(guān)的候選基因，可以作為有價(jià)值的候選基因應(yīng)用于蛋用鵪鶉的分子標(biāo)記輔助選擇。