黃佩佩 胡云明 吳建勝

非酒精性脂肪性肝病以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕±硖卣鳎◤膯渭兏沃咀冃缘椒蔷凭灾拘愿窝?，一些患者最終可演變?yōu)楦斡不踔粮渭?xì)胞癌[1]。據(jù)報(bào)道一般人群的非酒精性脂肪性肝病發(fā)生率為10%～16%，而在肥胖患者中發(fā)生率高達(dá)38%，近年來(lái)隨著人們工作壓力的增加，飲食、生活習(xí)慣不規(guī)律，非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)[2]。目前臨床對(duì)非酒精性脂肪性肝病尚缺乏特效治療藥物，治療方法主要是改變患者的生活方式、減輕體質(zhì)量等[3]。鹽酸小檗堿片是從中藥黃連根莖中提取的主要生物堿，對(duì)糖尿病、高脂血癥、肥胖癥等代謝綜合征起到了防治療效，也是一種治療非酒精性脂肪性肝病的藥物。甘草酸二銨腸溶膠囊能夠促進(jìn)非酒精性脂肪性肝病患者的糖脂代謝好轉(zhuǎn)，有抗炎、改善胰島素抵抗以及保護(hù)肝細(xì)胞等作用[5]。然而目前采取水飛薊賓膠囊聯(lián)合鹽酸小檗堿片治療非酒精性脂肪性肝病的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。非酒精性脂肪性肝病是一種多因素作用所導(dǎo)致的臨床病理綜合征，免疫功能失衡和腸道菌群紊亂在該病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[6,7]?；诖?，本研究選取溫州醫(yī)科大學(xué)附屬樂(lè)清醫(yī)院2017年2月～2018年8月收治的104例病例作為研究對(duì)象，觀察鹽酸小檗堿片聯(lián)合甘草酸二銨腸溶膠囊治療非酒精性脂肪性肝病的治療效果，并探討其對(duì)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(Treg)/輔助性T細(xì)胞17(Th17)平衡以及腸道菌群的影響。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象: 104例非酒精性脂肪性肝病患者來(lái)源于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬樂(lè)清醫(yī)院2017年2月～2018年8月收治病例，非酒精性脂肪性肝病診斷參照《中國(guó)非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010 年修訂版)》擬定[8]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合非酒精性脂肪性肝病診斷標(biāo)準(zhǔn)者；②患者年齡20～65歲；③丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)異常升高≥4周；④近1個(gè)月內(nèi)未給予相關(guān)藥物治療；⑤患者自愿參加，且簽署知情協(xié)議。排除標(biāo)準(zhǔn)：①飲酒史或乙醇量女性每周>70克/周，男性>140克/周；②伴病毒性肝炎、酒精性肝病、藥物性肝病、肝豆?fàn)詈俗冃圆〉绕渌尾?③對(duì)本研究藥物過(guò)敏者；④合并心腦血管、腎臟、造血系統(tǒng)等嚴(yán)重疾?。虎莼季窦膊≌?。兩組治療過(guò)程中均未出現(xiàn)脫落病例，將104例患者按數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組和觀察組，每組各52例。對(duì)照組男性31例，女性21例，年齡44～62歲，平均年齡55.17±7.12歲，病程3～7年，平均病程5.11±0.71年，體重指數(shù)25.15±3.04kg/m2；并發(fā)癥：2型糖尿病8例，高血壓15例，高脂血癥19例。觀察組男性33例，女性19例，患者年齡46～61歲，平均年齡55.39±7.04歲，病程2.5～7.0年，平均病程5.01±0.67年，體重指數(shù)25.09±3.04kg/m2；并發(fā)癥：2型糖尿病7例，高血壓13例，高脂血癥18例。上述基本臨床資料兩組患者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

2.方法：(1)基礎(chǔ)治療：依據(jù)指南[8]給予非藥物干預(yù)措施。包括對(duì)患者進(jìn)行健康教育；平衡膳食，控制體重；注意休息，適當(dāng)有氧運(yùn)動(dòng)(每周>4次，每次>30min)。對(duì)照組：采取甘草酸二銨腸溶膠囊(正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)H20040628)，口服，3粒/次，3次/天。觀察組：在對(duì)照組治療基礎(chǔ)上給予鹽酸小檗堿片(南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司，批準(zhǔn)文號(hào)H32023081)，口服1～3片/次，3次/天。兩組療程均為12周。

3.觀察指標(biāo)：(1)肝功能：采取全自動(dòng)生化分析儀(AU5800，美國(guó)Beckman Coulter公司)測(cè)定患者的谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)以及谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)，在治療前及治療12周后各測(cè)1次。(2)血脂:采取全自動(dòng)生化分析儀(AU5800，美國(guó)Beckman Coulter公司)檢測(cè)患者的總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)以及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平，在治療前及治療12周后各測(cè)1次。(3)兩組外周血輔助性T細(xì)胞17(Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)水平:清晨空腹下抽取患者的外周血3ml左右，常規(guī)離心后將其加入磷酸鹽緩沖液洗滌，制備細(xì)胞懸液；采取流式細(xì)胞儀(FC-500型，美國(guó)Beckman Coulter公司)在治療前及治療12周后測(cè)定，其中Th17細(xì)胞為CD4+白細(xì)胞介素(IL)-17+，Treg細(xì)胞為CD 4+CD25+CD127lowTreg。(4)兩組腸道菌群測(cè)定:標(biāo)本取樣：在治療前及治療結(jié)束后留取患者的自然排便新鮮糞便中段0.5g，置于樣本袋存于-4℃冰箱。標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA提取：取雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌、腸球菌凍干粉各0.2g，溶解于磷酸緩沖液溶液中，采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA，采用紫外分光光度計(jì)定量，進(jìn)行10倍稀釋，采用系統(tǒng)軟件分析循環(huán)閾值(Ct)，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品PCR片段拷貝數(shù)。樣本細(xì)菌DNA提取、16SrDNA定量PCR：糞便樣本融凍，取0.2g以磷酸鹽緩沖液處理，1000r/min離心10min，取上清200μl，同標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA提取法提取樣本細(xì)菌DNA，以標(biāo)準(zhǔn)菌株16SrDNA V3區(qū)為PCR靶基因，采用Primer Premier 6.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)PCR引物，對(duì)樣本細(xì)菌DNA提取液施行PCR反應(yīng)，生成樣本細(xì)菌Ct值，計(jì)算樣本拷貝數(shù)。(5)療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)[9]:根據(jù)患者的肝臟酶學(xué)改變制定。臨床控制：肝臟酶學(xué)恢復(fù)正常；顯效：肝臟酶學(xué)指標(biāo)降低≥50%；有效：肝臟酶學(xué)指標(biāo)降低<50%但≥30%；無(wú)效：肝臟酶學(xué)指標(biāo)降低<30%?？傆行?%)=(臨床控制+顯效+有效)人數(shù)/各組人數(shù)。

結(jié) 果

1.兩組肝功能比較：治療12周后，兩組患者肝功能AST、ALT、GGT水平明顯降低(P<0.01)；且觀察組治療后AST、ALT、GGT水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，詳見(jiàn)表1。

表1 兩組肝功能比較

2.兩組LDL-C、TC、TG、HDL-C比較：治療12周后，兩組HDL-C明顯升高，LDL-C、TC和TG明顯降低(P<0.01)；且觀察組患者治療12周后 LDL-C、TC和TG少于對(duì)照組，HDL-C高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，詳見(jiàn)表2。

表2 兩組LDL-C、TC、TG、 HDL-C比較

3.兩組肝臟酶學(xué)療效比較：治療12周后，觀察組總有效率為94.23%，顯著多于對(duì)照組(76.92%,χ2=4.986，P<0.05)，詳見(jiàn)表3。

表3 兩組肝臟酶學(xué)療效比較[n(%)]

4.兩組外周血Th17和Treg細(xì)胞水平比較：治療12周后，兩組患者外周血Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞以及Treg/Th17比值顯著減少(P<0.01)；且觀察組治療12周后外周血Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞以及Treg/Th17比值少于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，詳見(jiàn)表4。

表4 兩組外周血Th17和Treg細(xì)胞水平比較

5.兩組腸道菌群比較：治療12周后，兩組患者的雙歧桿菌、乳酸桿菌水平顯著升高，大腸桿菌明顯減少(P<0.01)，且觀察組患者的雙歧桿菌、乳酸桿菌顯著高于對(duì)照組，大腸桿菌明顯低于對(duì)照組(P<0.01)；兩組治療前腸球菌水平變化比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)表5。

表5 兩組腸道菌群比較拷貝數(shù)/克)

討 論

非酒精性脂肪性肝病是臨床常見(jiàn)慢性肝病之一，患者常合并代謝綜合征，與胰島素抵抗、肥胖、遺傳易感等密切相關(guān)，但其發(fā)病機(jī)制尚待闡明。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)普遍認(rèn)為“二次打擊”學(xué)說(shuō)是非酒精性脂肪性肝病發(fā)生、發(fā)展的主要機(jī)制之一，初次打擊為脂質(zhì)代謝紊亂和胰島素抵抗導(dǎo)致體內(nèi)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積形成單純性脂肪肝；第2次打擊為多種因素誘發(fā)氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過(guò)氧化損害，從而損傷肝臟以及導(dǎo)致肝細(xì)胞變性、壞死，形成脂肪性肝炎[10,11]。

鹽酸小檗堿通過(guò)興奮胰島素受體mRNA轉(zhuǎn)錄以及蛋白激酶C依賴激活啟動(dòng)子增加胰島素受體基因表達(dá)，促進(jìn)胰島素受體的生成，進(jìn)而增加胰島素的敏感度；同時(shí)也通過(guò)抑制線粒體和激活腺苷酸活化蛋白激酶，下調(diào)肝糖異生基因以及脂肪合成基因，調(diào)節(jié)異常脂質(zhì)代謝，達(dá)到降血脂、血糖的作用[12,13]。甘草酸二銨腸溶膠囊為甘草酸二胺和磷脂酰膽堿的新型復(fù)合物，甘草酸二胺有較強(qiáng)的抗炎、保護(hù)肝細(xì)胞及改善肝功能的作用；磷脂與肝細(xì)胞膜有較高的親和性，可維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性、保護(hù)肝細(xì)胞膜，磷脂中的膽堿對(duì)脂肪有一定的親和力，可有效降低血清甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇[14]。甘草酸二銨與磷脂結(jié)合以后，脂溶性明顯增高，生物利用度也明顯增加，產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，臨床可用于治療急、慢性病毒性肝炎等所引起的肝功能異常，亦能降低非酒精性脂肪性肝病患者的轉(zhuǎn)氨酶及血脂升高[15]。

本研究結(jié)果顯示，治療12周后，觀察組治療后AST、ALT、GGT水平以及LDL、TC和TG低于對(duì)照組，HDL-C高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示鹽酸小檗堿片聯(lián)合甘草酸二銨腸溶膠囊治療非酒精性脂肪性肝病可促進(jìn)患者肝功能和血脂水平好轉(zhuǎn)。治療12周后療效統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，觀察組總有效率為94.23%，顯著多于對(duì)照組(76.92%)，說(shuō)明鹽酸小檗堿片聯(lián)合甘草酸二銨腸溶膠囊治療非酒精性脂肪性肝病的療效更佳，值得臨床借鑒。

非酒精性脂肪性肝病的“二次打擊”學(xué)說(shuō)認(rèn)為免疫系統(tǒng)激活是第2次打擊的主要參與因素之一，其中免疫微環(huán)境的改變是其重要病理特征，與免疫炎性細(xì)胞因子失衡有關(guān)[16]。Th17細(xì)胞均為CD4+淋巴細(xì)胞亞群，其主要分泌或誘導(dǎo)白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子-α 等促炎性細(xì)胞因子，介導(dǎo)炎性反應(yīng)，造成肝組織損害[8]。Treg細(xì)胞也是CD4+淋巴細(xì)胞亞群之一，可通過(guò)分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β以及細(xì)胞直接接觸，并作為抗原呈遞細(xì)胞的各種免疫細(xì)胞發(fā)揮直接作用，促進(jìn)肝臟發(fā)生纖維化[17]。Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞相互作用，在生理狀態(tài)下保持平衡以維持機(jī)體免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。唐濤等[18]研究發(fā)現(xiàn)，非酒精性脂肪性肝病患者外周血中Th17和Treg細(xì)胞在T 淋巴細(xì)胞中的比例均顯著升高并且Th17/Treg的比例也明顯增加，與胰島素抵抗存在一定的相互作用，參與了非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。本研究觀察組外周血Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞以及Treg/Th17比值明顯少于對(duì)照組，提示鹽酸小檗堿片聯(lián)合甘草酸二銨腸溶膠囊可能通過(guò)調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞對(duì)非酒精性脂肪性肝病起到一定治療作用。

腸道與肝臟在結(jié)構(gòu)與功能上存在解剖學(xué)、病理生理聯(lián)系，腸道菌群的紊亂是非酒精性脂肪性肝病的病理機(jī)制之一。腸道有害細(xì)菌過(guò)多及益生菌減少，引起有害代謝物質(zhì)產(chǎn)生過(guò)多，并進(jìn)入肝臟導(dǎo)致肝臟炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等，形成肝脂肪變性和纖維化；肝臟疾病患者的腸道菌群營(yíng)養(yǎng)底物、膽汁分泌以及腸道內(nèi)膽鹽不足，門(mén)靜脈回流受阻，導(dǎo)致胃腸道淤血內(nèi)積，肝臟分泌大量炎性因子，加重腸道菌群失衡[19]。易艷容等[20]研究顯示，非酒精性脂肪性肝病患者的腸道有益菌雙歧桿菌及乳桿菌數(shù)量顯減少，有害菌腸桿菌和腸葡萄球菌數(shù)量明顯增加，使腸源性內(nèi)毒素增多，引起炎性介質(zhì)的大量釋放，進(jìn)一步損害肝細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，觀察組的雙歧桿菌、乳酸桿菌顯著高于對(duì)照組，大腸桿菌明顯低于對(duì)照組。朱超霞等[21]研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿可能通過(guò)改善腸道菌群的結(jié)構(gòu)和減輕高脂飲食所致腸道黏膜損傷，對(duì)高脂飲食所誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝病發(fā)揮治療作用。提示鹽酸小檗堿片聯(lián)合甘草酸二銨腸溶膠囊通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂可能是其治療非酒精性脂肪性肝病的有效途徑之一。

綜上所述，鹽酸小檗堿片聯(lián)合甘草酸二銨腸溶膠囊治療非酒精性脂肪性肝病可促進(jìn)患者肝功能和血脂水平的改善，提高療效，調(diào)節(jié)Th17Treg細(xì)胞失衡和改善腸道菌群紊亂可能與上述治療效果有關(guān)。