楊 飛 鈕崢嶸 李瑞軒 徐桂萍

氯胺酮(ketamine，KTM)是常用麻醉類藥物，臨床多用于嬰幼兒麻醉[1，2]。近年來，隨著國家計劃生育政策的調(diào)整，新生兒數(shù)量不斷增加，臨床應(yīng)用氯胺酮對嬰幼兒實施檢查和手術(shù)麻醉的病例亦不斷增加。但有研究表明，氯胺酮在麻醉時可引發(fā)神經(jīng)毒性和記憶損害等不良反應(yīng)，并可引起認知功能減退[3，4]。因此，氯胺酮對發(fā)育中大腦的神經(jīng)毒性作用越來越引起醫(yī)學(xué)界的廣泛重視[5]。

黃芪來源于豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，被《中國藥典》2015年版收載，其性微溫，味甘，具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌之功效[6]。黃芪總苷是黃芪中的主要藥效成分，屬于皂苷類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗缺血性腦損傷、抗衰老和改善記憶等多種藥理作用[7～9]。但有關(guān)黃芪總苷對氯胺酮麻醉致幼鼠記憶損傷的防治作用及其機制研究尚未見報道。為此，本研究中以氯胺酮麻醉幼鼠復(fù)制記憶損傷模型，研究黃芪總苷對其治療作用，并探討其可能的作用機制。

材料與方法

1.實驗動物：SD大鼠，50只，清潔級，21日齡幼鼠，雌雄各半，體質(zhì)量50±2g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。

2.藥物與試劑：黃芪總苷(含量：98%，批號：EY-(USP)-0202，上海遠慕生物科技有限公司)，鹽酸氯胺酮注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒，南京建成生物工程研究所。caspase-3抗體、Bcl-2抗體、GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標記二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，BCA蛋白測定試劑盒(美國Thermo公司)；ECL發(fā)光液和硝酸纖維素膜(美國Millipoer公司)。

3.儀器：Morris水迷宮(上海基爾頓生物科技有限公司)；Nikon ECLIPSE 80i正置顯微鏡；H1650臺式高速離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)；SpectraMax iD5-多功能酶標儀(中國上海美谷分子儀器有限公司)；BT125D型萬分之一電子天平(Sartorius公司)；Morris水迷宮及視頻分析軟件。

4.動物分組及給藥：50只SD幼鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為5組，即正常對照組、氯胺酮組、氯胺酮+黃芪總苷高劑量(80mg/kg)組，氯胺酮+黃芪總苷中劑量(40mg/kg)組、氯胺酮+黃芪總苷低劑量(20mg/kg)組，每組各10只。氯胺酮組及氯胺酮+黃芪總苷組腹腔注射氯胺酮(50mg/kg)，空白對照組腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液。除正常對照組外，其余各組麻醉至翻正反射消失后，行假手術(shù)處理，無菌操作，于上腹部正中線做一長約1.5cm切口，探查腹部5min，關(guān)腹，縫合傷口。術(shù)后，氯胺酮+黃芪總苷各組分別灌胃相應(yīng)劑量黃芪總苷，1次/天，連續(xù)1周，正常對照組、氯胺酮組灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液。

5.學(xué)習(xí)記憶實驗：采用Morris水迷宮，末次給藥后，將各組動物禁食不禁水12h，進行定向航行實驗和空間探索實驗。將各組幼鼠放入水槽自由游泳2min，適應(yīng)迷宮內(nèi)、外環(huán)境及游泳狀態(tài)，持續(xù)訓(xùn)練3天，2次/天；第4天起，開始定位巡航實驗，幼鼠從4個不同的標記點分別入水，記錄其自入水到爬上平臺所需要的時間(逃避潛伏期)，如果幼鼠在90s內(nèi)未找到平臺，則將其引導(dǎo)至平臺休息10s，逃避潛伏期記為90s。定位巡航結(jié)束后進行1天的空間探索實驗，撤出平臺，將幼鼠放入水中自由游泳，記錄各鼠首次穿過平臺所在象限需要的時間以及在90s內(nèi)穿過平臺的次數(shù)。采用Morris水迷宮圖像自動監(jiān)視處理系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)的采集和處理。

6.血清SOD、MDA水平測定：學(xué)習(xí)記憶實驗結(jié)束后，以10%水合氯醛(3.5ml/kg)對各組幼鼠進行麻醉，腹主動脈取血5ml，室溫靜置2h，4℃下3000r/min離心5min，分離血清，迅速至-80℃冰箱保存，用于檢測血清SOD活性及MDA含量。

7.腦組織病理學(xué)檢查：取血完畢后，立即斷頭取幼鼠大腦海馬組織，一部分置液氮中凍存，另一部分以4%多聚甲醛溶液固定，4℃過夜，梯度乙醇脫水、石蠟包埋、制成4μm切片，用于蘇木精-伊紅(HE)染色檢測病理變化。

8.Western blot法檢測腦組織中Bcl-2、caspase-3蛋白的表達：處死動物后，取凍存海馬區(qū)腦組織50mg，液氮中研磨，加入組織裂解液裂解后，BCA法進行蛋白定量，加5×上樣緩沖液煮沸10min，進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后經(jīng)PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，Bcl-2、caspase-3一抗(1∶1000)稀釋液室溫孵育2h，繼以辣根酶標記的二抗(1∶5000)稀釋液室溫孵育1h，按照ECL試劑盒說明書進行操作，將發(fā)光液均勻地滴在PVDF膜上，反應(yīng)1 min，最后將膜放入暗室壓片成像。結(jié)果用目的蛋白的灰度值與內(nèi)參(GAPDH)的灰度值的比值表示，用Image J軟件對成像結(jié)果進行定量。

結(jié) 果

1.黃芪總苷對氯胺酮麻醉致記憶損傷幼鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)影響：正常對照組幼鼠大腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元細胞密集，數(shù)量多，橢圓形或圓形，排列整齊，神經(jīng)元胞質(zhì)豐滿，核仁明顯；氯胺酮組海馬區(qū)神經(jīng)元細胞排列疏松，細胞體積縮小，細胞核緊縮，神經(jīng)元細胞數(shù)量較少，提示氯胺酮麻醉可導(dǎo)致幼鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細胞損傷；氯胺酮+黃芪總苷各劑量組神經(jīng)細胞排列較為緊密，細胞核仁清晰，數(shù)量較多，提示黃芪總苷對氯胺酮導(dǎo)致幼鼠海馬區(qū)損傷的神經(jīng)元細胞具有一定的修復(fù)作用(圖1)。

圖1 各組幼鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)比較(HE,×400)A.正常對照組；B.氯胺酮組；C.氯胺酮+黃芪總苷高劑量組；D.氯胺酮+黃芪總苷中劑量組；E.氯胺酮+黃芪總苷低劑量組

2.黃芪總苷對氯胺酮麻醉致幼鼠記憶損傷的影響：定位巡航階段第1天和第2天，氯胺酮組、氯胺酮+黃芪總苷各劑量組的潛伏期均顯著高于正常對照組(P<0.05)，氯胺酮組與氯胺酮+黃芪總苷各劑量組間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示氯胺酮麻醉可造成幼鼠記憶損傷。第3天氯胺酮+黃芪總苷各劑量組與正常對照組幼鼠逃避潛伏期比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，顯著低于氯胺酮組(P<0.05)，詳見表1?？臻g探索實驗中，氯胺酮組首次穿過平臺所在象限需要的時間顯著長于正常對照組，穿臺次數(shù)顯著少于正常對照組，氯胺酮+黃芪總苷各劑量組首次穿過平臺所在象限需要的時間顯著短于氯胺酮組(P<0.05)，穿臺次數(shù)顯著多于氯胺酮組(P<0.05)，詳見表2。

3.黃芪總苷對氯胺酮麻醉致幼鼠記憶損傷幼鼠血清SOD、MDA水平的影響：與正常對照組比較，氯胺酮組幼鼠血清SOD活性顯著下降，MDA含量顯著提升(P<0.05)；與氯胺酮組比較，氯胺酮+黃芪總苷各劑量組幼鼠血清SOD活性顯著提升，MDA含量顯著降低(P<0.05)，詳見表3。

表1 黃芪總苷對氯胺酮麻醉致記憶損傷幼鼠定位巡航實驗結(jié)果的影響

表2 黃芪總苷對氯胺酮麻醉致記憶損傷幼鼠空間探索實驗結(jié)果的影響

表3 黃芪總苷對氯胺酮麻醉致幼鼠記憶損傷幼鼠血清中SOD、MDA水平的影響

4.黃芪總苷對氯胺酮麻醉致記憶損傷幼鼠腦組織中Bcl-2、caspase-3蛋白水平的影響：與正常對照組比較，氯胺酮組幼鼠腦組織caspase-3蛋白表達水平顯著升高，而Bcl-2表達水平顯著降低(P<0.05)；與氯胺酮組比較，氯胺酮+黃芪總苷各劑量組幼鼠腦組織caspase-3蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)，而Bcl-2表達水平均顯著升高(P<0.05)，詳見圖2。

圖2 各組幼鼠腦組織中Bcl-2、caspase-3蛋白相對表達量比較與正常對照組比較，*P<0.05；與氯胺酮組比較,#P<0.05

討 論

全身麻醉藥的主要不良反應(yīng)表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶功能障礙。越來越多的研究表明，氯胺酮可影響幼年幼鼠學(xué)習(xí)和記憶功能[10]。研究發(fā)現(xiàn)，多次使用氯胺酮可損傷動物海馬神經(jīng)元，影響其學(xué)習(xí)記憶功能，其機制與氯胺酮影響動物腦內(nèi)5-羥色胺(5-HT)和乙酰膽堿(Ach)水平有關(guān)[11]。水迷宮實驗是一種強迫大鼠、小鼠等實驗動物游泳，經(jīng)過訓(xùn)練對環(huán)境和平臺有空間記憶，判斷并尋找隱藏在水中平臺的一種實驗方法，主要用于測試實驗動物對空間位置感和方向感的學(xué)習(xí)記憶能力，當水下平臺被撤回時，通過平臺位置的插入頻率來確定動物的記憶。該實驗方法廣泛應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶、阿爾茨海默病、智力與衰老等方面的研究，是目前公認的用于研究學(xué)習(xí)和記憶能力的方法[12，13]。本研究通過水迷宮實驗證實，應(yīng)用氯胺酮麻醉后，幼鼠逃避潛伏期顯著延長，提示復(fù)制氯胺酮致幼鼠記憶功能損傷模型成功。

細胞凋亡反映細胞損傷的表現(xiàn)形式之一，其形成過程涉及到多種影響因素和作用機制所介導(dǎo)的細胞死亡過程。但無論哪種作用因素誘導(dǎo)細胞凋亡，其信號通路中均存在共同的調(diào)控靶點。凋亡蛋白酶caspase-3的激活是細胞凋亡的指示劑，屬于caspase級聯(lián)反應(yīng)中最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，其在細胞凋亡程序中起樞紐作用。Bcl-2是一種抑制凋亡基因，在細胞凋亡過程中，Bcl-2亦發(fā)揮關(guān)鍵作用，其可通過與其他凋亡蛋白的協(xié)同作用，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)線粒體膜通透性，從而調(diào)節(jié)細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[14～16]。

氧化應(yīng)激損傷是由于機體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)遭到破壞致使自由基在體內(nèi)發(fā)生負反應(yīng)，生成超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫、過氧化亞硝基等自由基和非自由基活性產(chǎn)物，積累堆積造成機體組織細胞受損，從而導(dǎo)致細胞凋亡和壞死。因此，研究記憶損傷動物腦組織細胞凋亡時，并行研究氧化應(yīng)激損傷，有助于分析記憶損傷機制[17，18]。SOD是機體內(nèi)重要的氧自由基清除酶之一，可有效清除細胞內(nèi)各種自由基和非自由基活性產(chǎn)物，同時可以抑制過多的羥自由基的產(chǎn)生，從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少MDA等脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物生成[19，20]。

本研究結(jié)果顯示，黃芪總苷具有防治氯胺酮麻醉致幼鼠記憶損傷的作用。氯胺酮+黃芪總苷各劑量組的潛伏期均顯著低于氯胺酮組，首次穿過平臺所在象限需要的時間顯著短于氯胺酮組，穿臺次數(shù)顯著多于氯胺酮組。氯胺酮組幼鼠血清中SOD活性下調(diào)、MDA含量升高，腦組織中Bcl-2表達減少、caspase-3表達量增高。給予不同劑量的黃芪總苷治療后，該情況出現(xiàn)改善，氯胺酮+黃芪總苷各劑量組幼鼠血清SOD活性顯著提高，MDA表達顯著降低，腦組織Bcl-2表達顯著增加，caspase-3表達減少。此研究結(jié)果表明，黃芪總苷能在一定程度上提高氯胺酮麻醉致記憶損傷幼鼠體內(nèi)SOD活性，并有效清除氧自由基，增強機體的抗氧化損傷能力。此外，可促進抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，降低凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達量。上述作用機制可能僅是一方面，有關(guān)黃芪總苷防治氯胺酮麻醉致幼鼠記憶損傷具體的作用機制，尚需進一步研究探討。