郝長杰，莊 平，3，趙 峰，3，張 濤，3，黃曉榮，方可菲，蔣 俊

（1.水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，上海海洋大學，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海與長江口漁業(yè)資源環(huán)境科學觀測實驗站，上海 200090）

暗紋東方鲀（Takifugu obscurus），俗稱河豚，隸 屬 鲀 形 目 （Tetraodontiformes），鲀 科（Tetraodontidae），東方鲀屬，屬江海洄游性魚類，主要分布于我國的黃海、渤海、東海和長江中下游及其通江湖泊［1］。暗紋東方鲀具有個體大、生長速度快、肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)價值高等優(yōu)點，曾是長江口及下游江段重要的漁業(yè)捕撈對象之一，目前已經(jīng)成為我國主要的養(yǎng)殖河鲀種類［2-3］。由于過度捕撈、環(huán)境污染等諸多因素，導致暗紋東方鲀天然資源嚴重衰退，20世紀80年代后已不能形成漁汛。增殖放流是恢復天然資源、維持生態(tài)平衡的重要手段之一［4-5］，但放流過程中標志、運輸?shù)拳h(huán)節(jié)會對魚體造成刺激和損傷，麻醉是減少魚體應激反應、提高放流成活率的重要技術手段。

麻醉劑因能夠起到一定的鎮(zhèn)定麻痹作用，被廣泛應用到水產(chǎn)動物的生產(chǎn)、運輸?shù)阮I域［6］。目前，可用于水產(chǎn)動物的麻醉劑種類繁多，有丁香酚、MS-222、苯唑卡因、2-苯氧乙醇等近30余種，其中在養(yǎng)殖和生產(chǎn)上使用最多的是MS-222和丁香酚［7-8］。MS-222是水產(chǎn)動物中普遍認為非常安全、有效的一種麻醉劑，在全世界范圍內(nèi)得到廣泛應用；丁香酚提取自丁香樹的莖葉和花朵，其優(yōu)點是廉價易得，但具有較強的揮發(fā)性，藥效會隨著時間的延長逐漸減弱［9-10］。目前，國內(nèi)外尚未見暗紋東方鲀麻醉研究的相關報道。本實驗通過研究MS-222和丁香酚兩種麻醉劑在不同濃度、不同水溫及麻醉后在空氣中不同的暴露時間對暗紋東方鲀幼魚麻醉效果的影響，以期為暗紋東方鲀的養(yǎng)殖生產(chǎn)、增殖放流等研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗于2018年11月在中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所實驗室進行，實驗幼魚平均全長（14.01±0.21）cm，平均體質(zhì)量（71.37±3.24）g，于12 m3循環(huán)水養(yǎng)池中暫養(yǎng)1月。實驗用水為鹽鹵和曝氣自來水配制而成，水溫（15.90±0.10）℃，鹽度 8.50±0.10，pH 7.80±0.10，保持溶氧7.50 mg·L-1以上，實驗開始前停食24 h。

1.2 實驗藥品

MS-222（北京格林恒興生物科技有限公司），水溶液呈弱酸性，為減少麻醉時產(chǎn)生的應激反應，使用時與碳酸氫鈉按質(zhì)量比1∶1混合溶于水。

丁香酚（國藥集團化學試劑有限公司），幾乎不溶于水，為提高溶解效率，使用時按質(zhì)量比1∶5溶于酒精后再溶于水。

1.3 暗紋東方鲀幼魚麻醉及復蘇過程分期及預實驗設置

實驗開始前，先進行預實驗。水溫（15.90±0.10）℃條件下，MS-222和丁香酚各設置10、20、30、40、50、60、70、80 mg·L-18個質(zhì)量濃度梯度組，每組10尾魚，各設2個平行，記錄魚的麻醉、復蘇時間并觀察最終麻醉狀態(tài)及復蘇情況。根據(jù)劉長琳等［7］的研究，同時結(jié)合暗紋東方鲀幼魚自身的行為特征對整個過程進行分期。

暴露時間梯度先進行預實驗，在水溫（15.90±0.10）℃條件下設 5、10、15、20、25 min 5個時間梯度。每組10尾魚，各設2個平行，觀察復蘇過程中的行為表現(xiàn)，記錄復蘇時間及成活率?；谝陨项A實驗結(jié)果開展以下實驗內(nèi)容。

1.4 MS-222和丁香酚對暗紋東方鲀幼魚麻醉及復蘇時間的確定

參考MARKING等［11］的研究結(jié)果，有效質(zhì)量濃度的標準為：實驗用魚在3 min內(nèi)麻醉、5 min內(nèi)復蘇，且麻醉時間長達15 min后成活率為100%。根據(jù)預實驗結(jié)果，設置MS-222濃度梯度為 100、110、120、130、140、150、160、170 mg·L-18個梯度組，丁香酚濃度梯度為50、60、70、80、90、100、110、120 mg·L-18個梯度組。實驗開始前，先將魚放到實驗桶中適應到穩(wěn)定階段，再加入麻醉劑，每組放10尾魚，各設3個平行，實驗時仔細觀察每條魚的活動狀態(tài)及行為特征，到達麻醉6期時，及時撈出，放入潔凈的海水中復蘇。記錄每尾魚到達麻醉6期和復蘇4期時所需的時間及成活率。其中，麻醉時間是指麻醉劑放入實驗桶中后實驗魚到麻醉6期所用的時間；復蘇時間指魚放入潔凈海水中后到復蘇4期時所需要的時間。

1.5 MS-222和丁香酚在不同水溫下對暗紋東方鲀幼魚的麻醉效果

根據(jù)1.3和1.4實驗結(jié)果，MS-222和丁香酚有效質(zhì)量濃度分別為120～140 mg·L-1和60～70 mg·L-1。選擇130 mg·L-1的 MS-222和60 mg·L-1的丁香酚進行不同水溫對暗紋東方鲀幼魚麻醉及復蘇的影響實驗。設置溫度梯度為：16、18、20、22、24℃，溫度用加熱棒調(diào)控，用數(shù)顯溫度計實時記錄水溫，保持溫度誤差≤0.10℃。每組10尾魚，各設3個平行，實驗前先將魚放入實驗桶中，緩慢提升水溫適應到穩(wěn)定階段后分別放入對應濃度的麻醉劑，記錄每尾魚麻醉和復蘇所需時間。

1.6 深度麻醉后空氣中不同暴露時間對暗紋東方鲀幼魚復蘇及成活率的影響

根據(jù) 1.3和 1.4實驗結(jié)果，選擇 130 mg·L-1的MS-222和60 mg·L-1的丁香酚進行空氣中不同暴露時間對暗紋東方鲀幼魚復蘇時間及成活率的影響實驗。設置MS-222暴露時間梯度為：5、10、15、20、25、30 min，丁香酚暴露時間梯度為：2、4、6、8、10、12、15、20 min，并設對照組（未暴露），每組10尾魚，各設3個平行，實驗水溫（15.90±0.10）℃。整個過程在濕潤潔凈的毛巾上進行，僅頭部露于空氣中，記錄復蘇時間及成活率。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)的分析和處理均采用Microsoft Excel和SPSS24.0統(tǒng)計軟件，并用單因素方差分析和Duncan法進行顯著性分析和多重比較，描述性統(tǒng)計結(jié)果以平均值±標準差（Mean±SD）表示，顯著性水平設為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 暗紋東方鲀幼魚麻醉及復蘇過程行為特征的觀察及分期

暗紋東方鲀幼魚在MS-222和丁香酚兩種麻醉劑的作用下，在麻醉階段和復蘇階段具有明顯不同的行為特征。據(jù)此，可以區(qū)分不同的麻醉階段（表1）和復蘇階段（表2）。

由表3可知，當MS-222在10～50 mg·L-1、丁香酚在10～20 mg·L-1時，幼魚的最終麻醉狀態(tài)始終保持在鎮(zhèn)定或輕度麻醉期，隨著麻醉劑濃度增加，麻醉程度加深，分別在60 mg·L-1和30 mg·L-1時進入麻醉6期（延髓麻醉期）。

2.2 MS-222和丁香酚對暗紋東方鲀幼魚麻醉、復蘇時間及有效質(zhì)量濃度的確定

MS-222對暗紋東方鲀幼魚的麻醉效果如圖1所示：隨著MS-222質(zhì)量濃度的上升，幼魚的麻醉時間逐漸縮短，復蘇時間逐漸延長。單因素方差分析可知：MS-222濃度為160 mg·L-1時，麻醉時間為（95.20±6.14）s，與 170 mg·L-1無顯著性差異（P＞0.05），復蘇時間各組均存在極顯著差異（P＜0.01）。MS-222的質(zhì)量濃度大于120 mg·L-1時，幼魚的平均麻醉時間小于3 min；MS-222的質(zhì)量濃度小于140 mg·L-1時，幼魚的平均復蘇時間小于5 min，且麻醉15 min后成活率為100%。根據(jù)MARKING等［11］有效質(zhì)量濃度的標準，得出MS-222對暗紋東方鲀幼魚的有效質(zhì)量濃度為120～140 mg·L-1。

從圖2可以看出，丁香酚對暗紋東方鲀幼魚的麻醉效果隨著質(zhì)量濃度的增加，麻醉時間逐漸縮短，復蘇時間逐漸延長。單因素方差分析可知：50 mg·L-1時，幼魚的麻醉時間為（192.00±15.23）s，顯著高于其他組（P＜0.05），復蘇時間為（218.00±11.20）s，顯著低于其他組（P＜0.05）。120 mg·L-1時麻醉時間縮短到（75.40±3.50）s，與 110 mg·L-1無顯著性差異（P＞0.05），復蘇時間延長到（494.60±11.93）s，極顯著高于其他組（P＜0.01）。同上麻醉時間小于3 min、復蘇時間小于5 min條件得出丁香酚對暗紋東方鲀幼魚的有效質(zhì)量濃度為60～70 mg·L-1。

表1 暗紋東方鲀幼魚麻醉過程的主要行為特征及分期Tab．1 Stages and main behavior characteristics of T．obscurus juveniles during anesthesia process

表2 暗紋東方鲀幼魚復蘇過程的主要行為特征及分期Tab．2 Stages and main behavior characteristics of T．obscurus juveniles during recovery process

表3 不同濃度MS-222和丁香酚對暗紋東方鲀幼魚的麻醉效果及程度分期Tab．3 Anesthetic effects and degree stages of different concentrations of MS-222 and clove oil on T．obscurus juveniles

圖1 不同濃度MS-222對暗紋東方鲀幼魚麻醉時間和復蘇時間的影響Fig．1 Effect of different MS-222 concentrations on anesthsesia time，recovery time in T．obscurus juveniles

圖2 不同濃度丁香酚對暗紋東方鲀幼魚麻醉時間和復蘇時間的影響Fig．2 Effect of different clove oil concentrations on anesthsesia time，recovery time in T．obscurus juveniles

2.3 兩種麻醉劑在不同水溫環(huán)境下對暗紋東方鲀幼魚麻醉效果的影響

從圖3可以看出，MS-222（130 mg·L-1）組隨著水溫的升高，麻醉時間和復蘇時間均逐漸縮短。單因素方差分析可知：麻醉時間溫度18℃組與16℃組無顯著性差異（P＞0.05），20℃組與22℃組無顯著性差異（P＞0.05），24℃組麻醉時間最短僅為（105.20±3.50）s，極顯著低于其他組（P＜0.01）；復蘇時間各組間均存在極顯著性差異（P＜0.01）。

圖3 不同水溫下MS-222對暗紋東方鲀幼魚麻醉效果的影響Fig．3 Anesthesia effect of MS-222 on T．obscurus juveniles in different temperatures

圖4表明，丁香酚（60 mg·L-1）組隨著水溫的升高，幼魚的麻醉和復蘇時間均逐漸縮短。麻醉時間各組間均存在顯著性差異（P＜0.05）；復蘇時間各組間均存在極顯著性差異（P＜0.01），24℃組復蘇時間已經(jīng)縮短到（157.00±6.99）s。

2.4 空氣中暴露時間對暗紋東方鲀幼魚復蘇效果的影響

由圖5可知，經(jīng)130 mg·L-1MS-222深度麻醉的幼魚，隨著在空氣中暴露時間的延長，復蘇時間先縮短后延長。單因素方差分析表明，復蘇時間各組間均存在顯著性差異（P＜0.05），幼魚在暴露20 min時復蘇時間為（204.58±6.23）s，與25 min組存在極顯著差異（P＜0.01），且自20 min后，復蘇時間的延長趨勢明顯加快。

圖4 不同水溫下丁香酚對暗紋東方鲀幼魚麻醉效果的影響Fig．4 Anesthesia effect of clove oil on T．obscurus juveniles in different temperatures

圖5 空氣中暴露時間對MS-222深度麻醉暗紋東方鲀幼魚復蘇時間的影響Fig．5 Effect of air exposure time on recovery time in MS-222 deep anesthesia T．obscurus juveniles

由圖6可知，經(jīng)60 mg·L-1丁香酚深度麻醉的幼魚，隨著暴露時間的延長，復蘇時間逐漸延長。單因素方差分析表明，暴露4 min與6 min復蘇時間無顯著性差異（P＞0.05），其余各組間均存在顯著性差異（P＜0.05）。暴露6 min后，幼魚的復蘇時間明顯延長，暴露15 min時幼魚的成活率為100%，但此時的復蘇時間已超過500 s，暴露20 min時幼魚成活率下降到80%。

圖6 空氣中暴露時間對丁香酚深度麻醉暗紋東方鲀幼魚復蘇時間的影響Fig．6 Effect of air exposure time on recovery time in clove oil deep anesthesia T．obscurus juveniles

3 討論

3.1 麻醉劑的作用機制與有效質(zhì)量濃度的確定

麻醉劑的主要作用是抑制腦皮質(zhì)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對機體產(chǎn)生一定的麻痹作用，從而在面對外界的刺激時，降低應激，達到一定的保護作用［12］。一般的麻醉劑首先會抑制腦的皮質(zhì)（觸覺喪失期），再作用于基底神經(jīng)節(jié)與小腦（興奮期），最后作用于脊髓（麻醉期）［13-14］。它能夠在一定的時間內(nèi)使魚體維持在一個休眠狀態(tài)，低消耗，低應激，新陳代謝緩慢，同時對氧氣的需求降低，二氧化碳及氨的排放也降低［15］。MS-222和丁香酚麻醉溶液首先通過魚的體表及鰓絲的呼吸作用進入到魚體內(nèi)的血液循環(huán)系統(tǒng)，之后再經(jīng)過血液的運輸作用傳導至腦部的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，能夠｀在很短的時間內(nèi)使魚的活動能力及反射能力受到抑制，且麻醉劑進入魚體內(nèi)后不能被完全降解，主要聚集于肝臟和脾臟中，肌肉中含量很低［16-17］。

從實驗結(jié)果可以看出：隨著麻醉劑濃度的逐漸增加，暗紋東方鲀幼魚的麻醉時間逐漸縮短，復蘇時間逐漸延長；MS-222和丁香酚濃度分別為60 mg·L-1和30 mg·L-1時，幼魚的最終麻醉程度能達到麻醉6期。即麻醉劑濃度越高，幼魚越容易麻醉而越不容易復蘇。這與彭寧東等［18］研究赤眼鱒（Spualiobarbus curriculus）幼魚和王秀華等［19］研究牙鲆（Paralichthys olivaceus）的研究結(jié)果一致。

MS-222和丁香酚對暗紋東方鲀幼魚的有效質(zhì)量濃度分別為120～140 mg·L-1與60～70 mg·L-1，與 胡 發(fā) 文 等［20］研 究 大 瀧 六 線 魚（Hexagrammos otakii）幼魚的研究結(jié)果不同，MS-222和丁香酚對大瀧六線魚幼魚的有效麻醉質(zhì)量濃度分別為 50～70 mg·L-1與 50～100 mg·L-1。這可能與兩種魚的生活習性、規(guī)格大小等有關，具體原因還需進一步研究。不同種類的麻醉劑及相同種類不同濃度的麻醉劑對不同的魚麻醉效果不同，因此，須根據(jù)魚體的大小、種類、健康生理狀況，以及生活的水溫、水質(zhì)等來選擇最合適的麻醉劑。

3.2 水溫對深度麻醉暗紋東方鲀幼魚麻醉及復蘇時間的影響

水溫是影響麻醉效果的一個重要環(huán)境因子［21］。魚類為變溫動物，在適宜溫度范圍內(nèi)，隨著水溫升高，魚的體溫也會升高，同時魚體內(nèi)也會發(fā)生一系列變化，細胞內(nèi)各種酶活性增強，各種生理生化反應隨之增強，新陳代謝處于較高水平，耗氧量增加［22-23］。本實驗結(jié)果表明：隨著水溫的升高，兩種麻醉劑的麻醉和復蘇時間均呈逐漸縮短趨勢，這與張民強等［24］等用MS-222對斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）的研究結(jié)果不同，其結(jié)果為隨著溫度的升高，斑點叉尾鮰的復蘇時間明顯延長。

暗紋東方鲀的最佳生存水溫為18～27℃，屬于暖水性魚類，對麻醉劑更為敏感［25-26］，推測隨著實驗水溫的逐漸升高，暗紋東方鲀的耗氧量上升，呼吸頻率增加，與周圍水體交換量增加，攝入相同含量的麻醉劑耗時會減少，所以麻醉時間會縮短，這與李樂等［27］采用 MS-222對硬頭鱒（Oncorhynchus mykiss）幼魚的研究結(jié)果相似；由于水溫上升，體內(nèi)谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶等［28］都處在較高水平，肝臟對麻醉劑降解能力顯著提升，因此，相應復蘇的時間也會縮短。在復蘇過程中觀察發(fā)現(xiàn)，在高水溫麻醉溶液中復蘇后的暗紋東方鲀幼魚活動力明顯高于低水溫麻醉溶液中的，但其內(nèi)在機理還有待進一步研究。以上研究結(jié)果也表明，水溫對魚體麻醉及復蘇效果的影響不僅與麻醉劑的種類有關，更與物種的差異性有關。

3.3 空氣中不同暴露時間對深度麻醉暗紋東方鲀幼魚復蘇時間的影響

暗紋東方鲀幼魚經(jīng)130 mg·L-1的MS-222和60 mg·L-1的丁香酚深度麻醉后，隨著在空氣中暴露時間的延長，MS-222處理組幼魚復蘇時間先縮短后延長，與COYLE等［29］研究MS-222對美洲鰣（Alosa sapidissima）的結(jié)果不同，其原因可能是美洲鰣應激性強，耗氧量大，對麻醉劑等外界刺激極為敏感。丁香酚處理組幼魚復蘇時間隨暴露時間延長而逐漸延長，這與趙艷麗等［30］研究丁香酚對大黃魚（Pseudosciaena crocea）的結(jié)果基本一致。

綜上所述：MS-222和丁香酚對暗紋東方鲀幼魚均具有良好的麻醉效果。結(jié)合實際情況，在暗紋東方鲀幼魚標志放流過程中，建議在水溫20～24℃時使用120～140 mg·L-1的MS-222進行麻醉，標記操作過程控制在25 min以內(nèi)；由于使用丁香酚麻醉后的幼魚在空氣中的可暴露時間較短，因此不建議采用。若在養(yǎng)殖、生產(chǎn)運輸?shù)绕渌I域，MS-222和丁香酚則均可選擇。本研究結(jié)果為暗紋東方鲀幼魚養(yǎng)殖、放流等研究中麻醉劑的合理使用提供了科學依據(jù)和技術支撐。麻醉是一個相對復雜的過程，魚體的大小、體質(zhì)量和水體鹽度、pH等都會對其效果產(chǎn)生影響。同時，麻醉劑對魚體耗氧率、排氨率、激素及酶活性等的影響還有待于進一步研究。