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        蠐螬提取物對實驗性兔視網(wǎng)膜靜脈阻塞HGF、VEGF表達的影響※

        2019-10-26 06:47:36梁凱霞蔣鵬飛彭清華
        中醫(yī)藥通報 2019年4期
        關(guān)鍵詞:模型

        ●梁凱霞 蔣鵬飛 彭 俊 彭清華,3▲

        視網(wǎng)膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion,RVO)發(fā)病率較高,多發(fā)于50~70歲中老年人,發(fā)病率無明顯性別差異,常單眼發(fā)病,以視網(wǎng)膜靜脈怒張迂曲為特征,受累靜脈區(qū)域有廣泛的出血、滲出或水腫。新生血管(CNV)是RVO的常見并發(fā)癥,治療困難,嚴重影響視功能,約15%的患者并發(fā)新生血管性青光眼。

        蠐螬具有破瘀、散結(jié)、止痛、解毒之功,《藥性論》言其“汁滴目中,去翳障,主血,止痛”。因此,蠐螬常用于目疾的治療。前期研究發(fā)現(xiàn)蠐螬提取物可促進RVO出血的吸收、抑制CNV的形成[1-2],但具體作用機制尚不明確。為進一步探討蠐螬抑制CNV的作用機制,本文觀察了蠐螬提取物對RVO模型HGF、VEGF表達的影響。

        1 實驗材料

        1.1實驗動物選取40只體重為1.8~2.3kg的健康實驗性兔,不限雌雄(動物許可證號:湘醫(yī)動字第30-015號)。

        1.2主要實驗藥品和試劑蠐螬提取物(參考陽長明的方法[3]制備);復方血栓通片;0.4%倍諾喜滴眼液;兔抗HGF多克隆抗體、兔抗VEGF多克隆抗體(均由武漢博士德生物工程有限公司提供)。

        1.3主要實驗儀器裂隙燈顯微鏡(蘇州六六視覺科技有限公司,型號:YZ5S);YZZOT型顯微鏡(蘇州醫(yī)療器械設(shè)備廠);PCR儀(德國Biometra);Mias-2000圖形分析系統(tǒng)(四川川大智勝軟件股份有限公司);Leica石蠟切片機(徠卡,型號RM2235)。

        2 實驗方法

        2.1動物分組采用隨機數(shù)字表法將40只實驗性兔隨機分為空白組、模型組、復方血栓通組、蠐螬提取物組4個組,每組均為10只動物。

        2.2造模方法模型組、復方血栓通組、蠐螬提取物組動物應(yīng)用光化學動力法[4]制作實驗性RVO模型,具體操作為:雙眼散瞳后,麻醉動物,將動物頭固定于裂隙燈前,安置三面鏡,以裂隙燈顯微鏡觀察動物眼底,激光器指示光斑定位于視盤邊緣的靜脈后,自動物耳緣靜脈緩慢推入20%熒光素鈉注射液(0.3mL/kg),30s內(nèi)推完,注藥后用激光照射雙側(cè)視網(wǎng)膜靜脈,同時注意避開伴行的動脈,遠端靜脈有明顯的擴張時即為造模成功。

        2.3動物給藥方法空白組、模型組以蒸餾水5mL/kg灌胃;復方血栓通組以復方血栓通0.1g/kg溶于蒸餾水中制成混懸劑,5mL/Kg灌胃;蠐螬提取物組以蠐螬提取物0.56g/100g灌胃。每日1次,持續(xù)至動物取材。于造模后1wk、3wk每組各隨機處死5只動物取材。

        2.4取材方法將實驗性兔耳緣靜脈注射空氣處死后,摘除兩只眼球,在手術(shù)顯微鏡下去除眼前節(jié)及玻璃體等多余組織,剝離激光斑部位視網(wǎng)膜,酒精脫水,石蠟包埋,切片,烘干備用。

        2.5測試檢測將取材的切片行蘇木精-伊紅染色,做免疫組化組織學檢測HGF與VEGF表達,每張切片均選取免疫組化陽性染色最多的4個視野框,用Mias-2000圖形分析系統(tǒng)測量視野框內(nèi)HGF與VEGF的平均光密度,在光學顯微鏡下主要觀察視網(wǎng)膜組織變化。

        3 結(jié)果

        造模后1wk:空白組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰,排列正常,HGF與VEGF少量表達于視網(wǎng)膜,與模型組、復方血栓通組、蠐螬提取物組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);模型組視網(wǎng)膜組織水腫,細胞排列較亂,尚無新生血管索,HGF與VEGF大量表達于視網(wǎng)膜,與復方血栓通組、蠐螬提取物組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);復方血栓通組、蠐螬提取物組視網(wǎng)膜組織水腫,細胞排列紊亂,HGF與VEGF少量表達于視網(wǎng)膜,兩組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。造模后3wk:空白組HGF與VEGF表達與造模后1wk時相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);模型組出現(xiàn)大量的新生血管索,但HGF與VEGF表達與造模后1wk時相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);復方血栓通組、蠐螬提取物組視網(wǎng)膜組織水腫減輕,無新生血管索,HGF與VEGF表達均較造模后1wk下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),但是兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1、表1。

        圖1 各組視網(wǎng)膜組織光鏡圖(HE,×400)

        注:①-⑦分別表示空白組、模型組給藥后1周、模型組給藥后3周、復方血栓通組給藥后1周、復方血栓通組給藥后3周、蠐螬提取物組給藥后1周、蠐螬提取物組給藥后3周視網(wǎng)膜HE染色。

        表1 各組HGF與VEGF陽性表達的平均光密度值

        注:與空白組比較,△P<0.05;與模型組比較:◇P<0.05;與1wk時比較:▲P<0.05。

        4 討論

        視網(wǎng)膜靜脈阻塞發(fā)生后,血液回流障礙,視網(wǎng)膜代償性形成新生血管[5-7],新生血管管壁僅有一層細胞構(gòu)成,極易發(fā)生出血[8-9],引起視力下降,持續(xù)的出血會對視網(wǎng)膜造成毒性損傷[10-11]。現(xiàn)代藥理研究認為蠐螬能夠治療RVO所致的視網(wǎng)膜病理損傷[1-2]。

        視網(wǎng)膜靜脈阻塞屬祖國醫(yī)學“絡(luò)瘀暴盲”范疇,《銀海精微·腎經(jīng)主病》認為本病病機為“屬相火上浮,水不能制?!薄躲y海指南·血病論》曰:“目得血而能視,血者氣之所化也。故血盛則形強,人生所賴,惟斯而已。潤經(jīng)絡(luò),澤臟腑,養(yǎng)筋骨,充滿一身,而目受其蔭,固宜通疏,而不宜淤滯者也?!北静〉陌l(fā)生與血液瘀滯密切相關(guān),而蠐螬有活血化瘀之功,切中本病病機。

        肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)最先從肝臟部分切除的鼠血清中分離出來,而后從鼠的血小板、肝臟及人的血清中分離出來,所以命名為肝細胞生長因子[13]。在眼部,HGF可由多種細胞產(chǎn)生,刺激眼內(nèi)多種細胞組織的生長和移行。多項研究[13-15]均說明HGF確實能介導視網(wǎng)膜新生血管形成。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)可促進血管內(nèi)皮細胞分裂,促進新生血管生成[16]。

        本研究結(jié)果顯示:模型組HGF、VEGF表達較空白組明顯上調(diào),復方血栓通組與蠐螬提取物組較模型組均有不同程度降低,但復方血栓通組與蠐螬提取物組相比,無統(tǒng)計學差異(P>0.05),兩組的CNV產(chǎn)生均少于模型組,提示復方血栓通組、蠐螬提取物組是通過下調(diào)HGF、VEGF以抑制CNV的發(fā)生。本研究也存在不足之處,如未將蠐螬按劑量分為不同組別,蠐螬對HGF與VEGF的抑制作用是否與劑量有關(guān)仍不得而知。如能進行深入研究,則有望為臨床尋找療效更佳、價格更低廉的藥物,創(chuàng)造更大的社會效益與經(jīng)濟效益。

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