趙赟鑫 張歡 周俞辛

摘要：根據(jù)紫杉醇的結構特點和紅豆杉中紫杉醇的合成機制，選取了幾種前體物質，研究其對紅豆杉內生真菌合成紫杉醇的影響。結果表明，在發(fā)酵培養(yǎng)的第10天，補加下列任一前體物質，使發(fā)酵液中初始濃度分別達到苯甲酸鈉30.0 mg/L，酪氨酸20.0 mg/L，L-苯丙氨酸3.0 mg/L，乙酸鈉3.0 g/L，均能提高紫杉醇產量。進一步采用L16（45）正交試驗分析得到，4種前體物質在培養(yǎng)基中的最佳組合為A3B3C3D1，即L-苯丙氨酸3.0 mg/L，酪氨酸40.0 mg/L，乙酸鈉3.0 g/L，苯甲酸鈉10.0 mg/L，對應發(fā)酵液中紫杉醇含量達到987.3 μg/L。

關鍵詞：紅豆杉;紫杉醇;內生真菌;前體物質;代謝調控;紫杉醇合成;生物量提高

中圖分類號： S182 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0234-05

近幾年來，關于紅豆杉產紫杉醇的研究進展得很快，國內外利用紅豆杉內生真菌產紫杉醇的研究報道逐漸增多，目前紅豆杉內生真菌產紫杉醇的含量普遍偏低，國內外學者正在不斷探索能夠提高紅豆杉內生真菌紫杉醇產量的途徑[1]。

前體是指加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中的某些化學物質，它能被微生物利用并直接結合到產物分子中去，而產物自身結構變化不大，有些還具有促進產物合成的作用。前體一般分為內源性前體和外源性前體，如短鏈脂肪酸等內源性前體由于是生物體自身代謝所合成的中間體，微生物對其都有較好的耐受性;而外源性前體由于微生物自身難以合成，其濃度較高時對產物合成和微生物的生長都有毒害作用[2]。

目前，對植物內生真菌生產紫杉醇的代謝調控研究較少，不過關于植物細胞生物合成紫杉醇的研究成果相對較多，對微生物發(fā)酵生產紫杉醇的研究具有很重要的借鑒價值。

紫杉醇的三環(huán)二萜骨架來自于甲瓦龍酸途徑，C13側鏈來自于苯丙氨酸，向培養(yǎng)基中添加苯丙氨酸可增加紫杉醇的生物合成量。Strobel等通過向培養(yǎng)基中添加苯丙氨酸、亮氨酸及乙酸鈉來研究前體物質對紫杉醇生物合成的影響，結果表明，苯丙氨酸、亮氨酸及乙酸鈉均能促進紫杉醇的生物合成，其中乙酸鈉不但能夠摻入到乙?；?，而且能夠摻入到紫杉烷骨架及苯環(huán)中，是紫杉醇合成的有效前體[3]。李家儒等在紅豆杉懸浮培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的L-苯丙氨酸、苯甲酸鈉、乙酸鈉、甘氨酸、α-旅烯、松節(jié)油，結果表明，各前體物對紅豆杉細胞生長均無明顯影響，卻都不同程度地促進了紫杉醇的合成[4]。但是，郭志剛等的研究卻得出了相反的結果，其研究發(fā)現(xiàn)，添加L-苯丙氨酸對紫杉醇的生物合成沒有顯著促進作用，苯甲酸鈉和乙酸鈉抑制紫杉醇的合成，他認為，C13側鏈合成的前體含量并不是紫杉醇生物合成的限制性因素[5]。

本研究采用筆者所在課題組自行分離的紫杉醇高產菌株Metarhizium anisopliae LB-10[6]為試驗對象，在對其培養(yǎng)基組成和配比[7]、發(fā)酵條件[8]研究的基礎上，根據(jù)紫杉醇的結構特點和紅豆杉中紫杉醇的合成機制，選取幾種前體物質，研究它們對紅豆杉內生真菌合成紫杉醇的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 紅豆杉內生真菌Metarhizium anisopliae LB-10是分離自陜西省留壩縣野生紅豆杉的高產紫杉醇內生真菌。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，馬鈴薯200 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂15.0～20.0 g，水 1.0 L，pH值6.0～8.0;種子培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）培養(yǎng)基，馬鈴薯200 g，葡萄糖20.0 g，水1.0 L，pH值6.0～8.0;發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50.0 g/L，NH4NO3 6.0 g/L，無水MgSO4 0.3 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，維生素B1 50.0 mg/L，pH值7.0。

1.1.3 藥品與試劑 紫杉醇標準品（≥98%）、乙酸乙酯、甲醇、葡萄糖、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、苯甲酸鈉、L-苯丙氨酸、乙酸鈉、酪氨酸。

1.1.4 主要儀器 高效液相色譜儀（LC 2000）、旋轉蒸發(fā)儀（RV-10，IKA）、電子天平（TB-214）、雙層恒溫干燥培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-2102C）、人工氣候箱（LRH-250-G-S）、數(shù)控超聲波清洗儀（KQ-5200-DE）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 種子液培養(yǎng)方法：在新鮮斜面上取 5 mm×5 mm大小的已純化菌塊，接種到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于25 ℃、180 r/min搖床上培養(yǎng) 3 d。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液混勻，按5%的接種量接種到裝有330 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于27 ℃、180 r/min 搖床上培養(yǎng)10 d。每次提取所用發(fā)酵液的量為 1 000 mL。

1.2.2 紫杉醇樣品的提取 通過對培養(yǎng)10 d的發(fā)酵液進行抽濾，使其分離為菌液和菌絲體2部分，菌絲體用乙酸乙酯在超聲條件下萃取，菌液用乙酸乙酯通過分液漏斗萃取，分別重復3次，合并收集乙酸乙酯相，并用雙層濾紙過濾，濾液在 40 ℃ 條件下旋轉蒸發(fā)至干，樣品用甲醇溶解并且定容至 10.0 mL，檢測。

1.2.3 紫杉醇的高效液相色譜檢測 將紫杉醇標準品用甲醇定容至10.0 mL，配置成濃度為0.01～0.16 mg/mL的溶液，繪制標準曲線。精密稱取紫杉醇標準品4.0 mg，用甲醇定容至10.0 mL，從而得到濃度為0.40 mg/mL的母液，將母液依次稀釋成濃度梯度為0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg/mL，取 20.0 μL 進樣（N=5，N表示參與標準曲線繪制的濃度點和響應值個數(shù)），得到的回歸方程為y=6.087 8+3 589.391 3x，r=0.999 222。建立標準曲線（圖1），采用外標法測定內生真菌發(fā)酵產物乙酸乙酯抽提物中的紫杉醇含量。

色譜條件：以水-甲醇-乙腈（體積比為33 ∶ 35 ∶ 32）為流動相，檢測波長為228 nm，流速為1.0 mL/min，進樣量為 20.0 μL，柱溫為室溫，色譜柱為C18（4.6 mm×150.0 mm）。

紫杉醇含量的計算公式：發(fā)酵液中紫杉醇的含量=[甲醇中紫杉醇的含量×溶解提取物所用甲醇的體積]÷提取時所取發(fā)酵液的體積。

每次提取的紫杉醇均作3個平行樣，分別經高效液相色譜（HPLC）測定并通過公式計算發(fā)酵液中紫杉醇的含量，求其平均值。

1.2.4 生物量的測定 取一定體積的發(fā)酵液在4 800 r/min轉速下離心20 min，菌絲體用蒸餾水洗滌2次，收集菌絲體，置于80 ℃烘箱中烘干至恒質量，稱質量，計算菌絲體生物量。

1.2.5 添加前體物質的研究方法

1.2.5.1 單因素試驗 以L-苯丙氨酸作為前體物質：采用蒸餾水作為助溶劑，采用“1.1.2”節(jié)中的發(fā)酵培養(yǎng)基和“1.2.1”節(jié)中的培養(yǎng)方法，在LB-10對數(shù)生長末期即發(fā)酵第10天，添加L-苯丙氨酸水溶液，使發(fā)酵液中其初始濃度分別達到1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L，以不添加L-苯丙氨酸水溶液作為空白對照，研究L-苯丙氨酸對LB-10菌絲體生物量和紫杉醇生物合成的單因素影響。

以苯甲酸鈉作為前體物質：采用蒸餾水作為助溶劑，在LB-10對數(shù)生長末期即發(fā)酵第10天，添加苯甲酸鈉水溶液，使發(fā)酵液中其初始濃度分別達到10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg/L，以不添加苯甲酸鈉水溶液作為空白對照，研究苯甲酸鈉對LB-10菌絲體生物量和紫杉醇生物合成的單因素影響。

以乙酸鈉作為前體物質：采用蒸餾水作為助溶劑，在 LB-10 對數(shù)生長末期即發(fā)酵第10天，添加乙酸鈉水溶液，使發(fā)酵液中其初始濃度分別達到1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L，以不添加乙酸鈉水溶液作為空白對照，研究乙酸鈉對LB-10菌絲體生物量和紫杉醇生物合成的單因素影響。

以酪氨酸作為前體物質：采用甲酸作為助溶劑，在LB-10對數(shù)生長末期即發(fā)酵第10天，添加酪氨酸甲酸溶液，使發(fā)酵液中其初始濃度分別達到5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 mg/L，以不添加酪氨酸甲酸溶液作為空白對照，研究酪氨酸對LB-10菌絲體生物量和紫杉醇生物合成的單因素影響。

1.2.5.2 正交試驗及驗證性試驗 選取對紫杉醇積累和菌體生長有較大影響的苯甲酸鈉、酪氨酸、L-苯丙氨酸和乙酸鈉的初始濃度，各取4個水平，均在發(fā)酵第10天加入發(fā)酵液中，以紫杉醇產量為指標，進行L16（45）正交試驗及驗證性試驗。

2 結果與分析

2.1 L-苯丙氨酸對LB-10紫杉醇產量和生物量的影響

苯丙氨酸是α-氨基酸的一種，具有生物活性的光學異構體為L-苯丙氨酸，為白色晶體或結晶性固體，溶于水，難溶于甲醇、乙醇和乙醚[9]。

由圖2可知，在0～3.0 mg/L濃度范圍內，LB-10的紫杉醇產量隨L-苯丙氨酸濃度的增加而增大，當L-苯丙氨酸的濃度為3.0 mg/L時，發(fā)酵液紫杉醇含量達到最大值，其平均含量為972.1 μg/L，當L-苯丙氨酸濃度為4.0 mg/L及以上時，紫杉醇的產量急劇下降，但是菌絲體生物量一直呈上升趨勢。表明L-苯丙氨酸對LB-10菌絲體生物量和紫杉醇生物合成具有明顯影響。高濃度的L-苯丙氨酸對菌絲體生長有利，由于紫杉醇的三環(huán)二萜骨架來自甲瓦龍酸途徑，C13側鏈來自于苯丙氨酸[10]，向培養(yǎng)基中添加苯丙氨酸可增加紫杉醇的合成量，因此，添加適量的L-苯丙氨酸可以較好地促進紫杉醇的生物合成。

2.2 苯甲酸鈉對LB-10紫杉醇產量和生物量的影響

苯甲?；羌t豆杉紫杉醇合成過程中的?；襟E之一，由于在C2位置上有苯甲?；@一基團[11]，因此苯甲酸可能是微生物合成紫杉醇的前體。由于苯甲酸在常溫下很難溶于水，直接使用苯甲酸進行研究比較困難，通常使用的是其鈉鹽，例如苯甲酸鈉，但苯甲酸仍然起主要作用。苯甲酸鈉，別稱安息香酸鈉，為白色顆?；蚪Y晶性粉末，在空氣中穩(wěn)定，易溶于水，且親油性較大[9]。

由圖3可知，在0～30.0 mg/L濃度范圍內，苯甲酸鈉對紫杉醇合成有明顯的促進作用，在添加量為30.0 mg/L時，發(fā)酵液中紫杉醇含量達到了983.2 μg/L，繼續(xù)增加濃度至 40.0 mg/L 時，紫杉醇產量開始下降，且苯甲酸鈉對菌絲體生長有明顯抑制作用。表明苯甲酸鈉對LB-10菌絲體生物量和紫杉醇生物合成具有明顯影響。高濃度的苯甲酸鈉對菌絲體生長不利，且添加適量的苯甲酸鈉可以較好地促進紫杉醇的生物合成。由于苯甲酸鈉的親油性較大，易穿透細胞膜進入細胞體內，干擾細胞膜的通透性，導致菌絲體加速老化。

2.3 乙酸鈉對LB-10紫杉醇產量和生物量的影響

乙酸鈉，俗名醋酸鈉，為無色無味的結晶體，在空氣中可被風化，可燃，溶于水和乙醚，微溶于乙醇[9]。由圖4可知，在0～3.0 g/L濃度范圍內，乙酸鈉對紫杉醇合成有明顯的促進作用，在添加量為3.0 g/L時，發(fā)酵液中紫杉醇平均含量達到了964.8 μg/L。繼續(xù)將濃度增加至4.0 g/L時，紫杉醇產量開始下降，且乙酸鈉在試驗范圍內對菌體生長有抑制作用。表明乙酸鈉對LB-10菌絲體生物量和紫杉醇生物合成具有明顯影響。高濃度的乙酸鈉對菌絲體生長不利，而添加適量的乙酸鈉可以較好地促進紫杉醇的生物合成。由于乙酸鈉不僅能摻入到苯環(huán)及紫杉烷骨架中，而且能摻入到乙?；?，因此是紫杉醇合成的有效前體。

2.4 酪氨酸對LB-10紫杉醇產量和生物量的影響

酪氨酸是一種白色結晶體或結晶粉末，易溶于甲酸，難溶于水，不溶于乙醇和乙醚[9]。由圖5可以看出，在0～20.0 mg/L 濃度范圍內，酪氨酸對紫杉醇合成和菌絲體生長均有明顯的促進作用，在添加量為20.0 mg/L時，發(fā)酵液中紫杉醇含量達到了980.9 μg/L，隨后繼續(xù)增大添加濃度，會抑制菌體生長和紫杉醇生物合成。表明酪氨酸對LB-10菌絲體生物量和紫杉醇生物合成具有明顯影響。由于L-苯丙氨酸在生物體內可被輔酶四氫生物蝶呤可逆地轉化為L-酪氨酸，而紫杉醇的三環(huán)二萜骨架來自甲瓦龍酸途徑，C13側鏈來自于苯丙氨酸[10]，因此酪氨酸是能夠間接提高紫杉醇產量的前體物質。

2.5 前體交互作用

“2.1～2.4”節(jié)中分析了4種前體物質及其濃度對發(fā)酵的單因素影響，由于各個試驗批次之間往往存在較大差別，因此需要對各因素進行綜合考察，才能確定較優(yōu)的前體組合。

本研究選取對紫杉醇積累和菌絲體生長有一定影響的 L-苯丙氨酸、酪氨酸、苯甲酸鈉和乙酸鈉為前體物質，各取4個水平，均在發(fā)酵第10天加入發(fā)酵液中，以紫杉醇產量為指標，進行L16（45）正交試驗，試驗設計見表1。

從表2可以看出，根據(jù)極差R值的大小得到，各因素對試驗結果影響次序為A>B>D>C，即L-苯丙氨酸對LB-10紫杉醇產量影響最大，其次是酪氨酸，再次是苯甲酸鈉，最后是乙酸鈉。

2.6 驗證性試驗

采用優(yōu)化后發(fā)酵液培養(yǎng)，在LB-10發(fā)酵培養(yǎng)的第10天，同時添加L-苯丙氨酸3.0 mg/L，酪氨酸40.0 mg/L，乙酸鈉3.0 g/L，苯甲酸鈉10.0 mg/L，繼續(xù)再培養(yǎng)4 d。以紫杉醇產量為指標，對LB-10菌株進行搖瓶發(fā)酵驗證試驗，分別提取5次紫杉醇樣品進行HPLC檢測。結果（表4）表明，LB-10紫杉醇產量的RSD為0.17%，說明測定方法重現(xiàn)性良好，發(fā)酵液中紫杉醇含量平均值達到 987.3 μg/L。

3 討論與結論

所謂代謝調控，就是通過定向改良細胞的代謝特性，對特定的生化反應進行修飾，從而實現(xiàn)合成新產物或提高目的產物產率以及減少副產物產率的目的。在正常的生理條件下，微生物總是通過協(xié)調系統(tǒng)最經濟地吸收和利用營養(yǎng)物質，用于合成細胞結構，進行生長和繁殖，一般不積累中間代謝產物。代謝人工調控是指打破微生物的代謝控制體系，使代謝朝著人們希望的方向進行。因此，在了解紫杉醇生物合成途徑和催化各步反應酶的特性后，有目的地控制培養(yǎng)條件，通過添加重要前體物質、誘導子及抑制劑，對關鍵酶活性進行調節(jié)，抑制其他無用的旁路途徑，是完全可以提高紫杉醇產量的。

本研究根據(jù)紅豆杉紫杉醇的合成機制和紫杉醇的結構特點，選取L-苯丙氨酸、苯甲酸鈉、乙酸鈉、酪氨酸分別作為前體物質，研究其對Metarhizium anisopliae LB-10合成紫杉醇的影響。結果表明，在發(fā)酵培養(yǎng)的第10天，補加任一生長調節(jié)劑，使發(fā)酵液中初始濃度分別為苯甲酸鈉30.0 mg/L，酪氨酸20.0 mg/L，L-苯丙氨酸3.0 mg/L，乙酸鈉3.0 g/L，均能提高紫杉醇產量。

進一步采用L16（45）正交試驗分析得到，4種前體物質在培養(yǎng)基中的最佳組合為A3B3C3D1，即L-苯丙氨酸 3.0 mg/L，酪氨酸40.0 mg/L，乙酸鈉3.0 g/L，苯甲酸鈉 10.0 mg/L，對應發(fā)酵液中紫杉醇含量達到987.3 μg/L。

本研究的幾種前體物質基本上都在濃度增加到一定程度后，產生了對紫杉醇合成的不利影響，原因在于對大部分前體而言，都能促進終產物的生成，但許多外源前體的加入又會抑制植物細胞或菌絲體的生長，從而最終影響了次生代謝終產物的產量，而添加外源前體的目的是要促進代謝終產物的生成，因此，要篩選前體的最佳添加濃度，不同的前體其最佳添加濃度是不同的，且前體濃度不同，對次生代謝物合成的影響也不同。

紫杉醇具有細胞毒害作用[12]，通常不會大量地合成，只有在特殊環(huán)境脅迫條件下，初生代謝受到抑制，次生代謝產物才會大量合成。在本試驗過程中發(fā)現(xiàn)，添加某些前體物質，在紫杉醇產量較高時，生物量卻較低。這就造成紫杉醇生物合成和菌絲體生長之間的矛盾，因此找到二者最佳平衡點是目前需要解決的問題，也是實現(xiàn)工業(yè)化生產的必要條件。

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