樊慶琦 楚秀生 隋新霞

摘要：研究小麥品種缺鐵脅迫苗期相關性狀的系統(tǒng)聚類，對山東省小麥種質資源的鑒定篩選和鐵營養(yǎng)高效種質的創(chuàng)新利用具有重要意義。以86個山東省品種為研究對象，通過正常培養(yǎng)和缺鐵營養(yǎng)液培養(yǎng)，考察苗期根部和地上部等苗期性狀，進行系統(tǒng)聚類。系統(tǒng)聚類分析結果顯示，按正常培養(yǎng)、缺鐵培養(yǎng)、脅迫指數，將上述品種分別分為4、7、4個類群。研究發(fā)現，缺鐵脅迫可導致小麥生根數量的減少和地上部分生長量的顯著降低，卻可促進根系生長量的增加;小麥品種濟南16、菏麥19應保證栽培苗期的鐵營養(yǎng)供應;濟南8號、煙農15具有較強的鐵耐受能力，可用于鐵營養(yǎng)高效的種質創(chuàng)新和分子機制研究。

關鍵詞：小麥;苗期;缺鐵脅迫;根系;聚類分析

中圖分類號： S512.101 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0081-04

鐵作為小麥生長發(fā)育必需的營養(yǎng)元素之一，具有重要的生物學功能。小麥根系能分泌脫氧麥根酸的物質，螯合土壤中的Fe3+離子[1-7]，經根系細胞的轉運通道吸收至植物體內，參與葉綠素合成、呼吸作用、生物固氮等重要的生理生化反應[8]，以維持小麥的正常生長。缺鐵可導致細胞膜變薄、細胞壁疏松、膜囊系統(tǒng)破壞，胞內細胞器如類囊體、葉綠素解體或液泡化，高爾基體膨脹等不利影響[9-12]。從表型性狀來看，可引起新葉的黃化失綠[13-14]，影響根系的生長[15]。

系統(tǒng)聚類主要通過樣本數據經中心化或標準化變換后，計算距離系數利用不同的聚類方法進行聚類，在生物科學中得到廣泛應用。唐啟義教授開發(fā)的DPS數據處理系統(tǒng)根據學者的研究提供了7種聚類距離的算法和9種聚類方法，為聚類分析提供了便利、簡捷的統(tǒng)計學工具[16]。

山東省農業(yè)科學院作物研究所保存山東省小麥地方品種、育成品種以及國內外引進資源等3 000余份[17]。為更好地加強種質資源系統(tǒng)科學的評價，本研究以保存的山東省1950年以來的86份小麥品種為試驗材料，進行缺鐵脅迫下小麥苗期相關性狀的聚類分析，為小麥種質資源的評價篩選和鐵營養(yǎng)高效種質創(chuàng)新提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗概況

試驗于2017年在山東省農業(yè)科學院作物研究所濟南試驗基地的人工智能氣候室（浙江求是人工環(huán)境有限公司設計制造）中進行。氣候室面積約20 m2，陽面為透光雙層玻璃，配備空調、LED燈、遮陽棚和降溫水簾等控溫控光設備，由微計算機自動控制光照度12 000 lx，恒溫25 ℃。

1.2 供試材料

所用86份小麥材料為山東省農業(yè)科學院作物研究所小麥種質資源庫保存，為1950年后搜集、引進或育成的品種。為盡可能增加小麥種質資源的遺傳豐富度，根據系譜剔除了親緣關系較近的品種（如姊妹系等），供試小麥材料信息見表1。

1.3 試驗方法

挑選每份小麥材料籽粒飽滿的種子15粒，3次重復。種子經1.5%次氯酸鈉消毒5 min后，腹股溝朝下，均勻擺放至珍珠棉和紗網縫制的發(fā)芽盤，發(fā)芽盤放入盛有1 L超純水的培養(yǎng)盒（15 mm×15 mm×20 mm）中，在人工智能溫室中發(fā)芽，光/暗周期16 h/8 h，光照度12 000 lx，溫度25 ℃，3 d換水1次。

發(fā)芽7 d后，仔細將種子從幼苗根部去除，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)。其中，對照處理營養(yǎng)液配方為：0.7 mmol/L K2SO4、0.1 mmol/L KCl、2 mmol/L Ca（NO3）2、0.5 mmol/L MgSO4、0.1 mmol/L KH2PO4、1 μmol/L H3BO4、0.5 μmol/L MnSO4、0.2 μmol/L CuSO4、0.5 μmol/L ZnSO4、0.01 μmol/L （NH4）6Mo7O24、100 μmol/L FeEDTA。缺鐵脅迫營養(yǎng)液配方除無FeEDTA外，其他如對照處理。營養(yǎng)液3 d換1次，培養(yǎng)15 d。

小麥幼苗于營養(yǎng)液中培養(yǎng)15 d后，每次挑選長相均勻粗壯的幼苗10株，以單株為單位采集根系數量、根系長度、根干質量和地上部分干質量等性狀。根系數量以根系伸長1 cm為標準采集，根系長度則以根基部至最長根系頂點的長度。從根系基部用剪刀分離，將根系和地上部分干質量分別放置牛皮紙袋中，于烘箱中105 ℃殺青30 min，以85 ℃恒溫烘干48 h至完全干燥，并用稱量精度為0.01 g電子電平稱質量，計算根冠比。根據對照和缺鐵脅迫的相關性狀，計算脅迫指數。公式為：式中：SI為脅迫指數;Fe-為材料缺鐵脅迫營養(yǎng)液培養(yǎng)的性狀值;Fe+為材料正常營養(yǎng)液培養(yǎng)的性狀值。

1.4 數據處理

數據利用DPS高級版進行系統(tǒng)聚類分析，聚類后不同類群的平均值計算則在Excel中進行。

2 結果與分析

2.1 不同處理及脅迫指數聚類距離和方法的比較

根據根系數量、根系長度、根干質量、地上部分干質量和根冠比的數據，利用DPS數據處理系統(tǒng)高級版提供的7種距離系數和9種聚類方法，對正常鐵營養(yǎng)、缺鐵脅迫和脅迫指數分別進行系統(tǒng)聚類的模擬。一般情況下，F值的概率低于 0.05 的類群數量被認為是較適合的。

鐵正常供應下，以卡方距離可變類平均法進行系統(tǒng)聚類，在劃分為4個類群時F值的概率值低于0.05，表明將供試品種分為4個類群比較適宜，其他距離和方法F值的概率均高于0.05。缺鐵脅迫情況下，以歐式平方距離可變類平均法，供試小麥材料在分為7個類群時的F值概率低于0.05，其他距離和聚類方法的模擬均高于0.05。同樣，脅迫指數在卡方距離和可變類平均法將供試小麥品種分為4個類群時，F值概率低于0.05，因此，脅迫指數將品種分為4個類群較為合適。

2.2 聚類結果

正常鐵營養(yǎng)可劃分為4個類群。類群1包含32個品種，類群2包含40個品種，類群3包含13個品種，類群4只有1個品種（濟麥19），分別占總樣本的37.21%、46.51%、15.12%、1.16%（圖1-A）。

缺鐵脅迫可將供試小麥品種劃分為7個類群。類群1包含24個品種，類群2包含34個品種，類群3包含11個品種，類群4包含2個品種（濟南8號和煙農15），類群5包含4個品種（西北60、復壯30、濟南18和山農21），類群6包含2個品種（濟南16和菏麥19），類群7包含9個品種，分別占總樣本的27.91%、39.53%、12.79%、2.33%、4.65%、2.33%、10.47%（圖1-B）。

脅迫指數可將小麥品種劃分為4個類群。類群1包含16個品種，類群2包含56個品種，類群3包含6個品種，類群4包含8個品種，分別占總樣本的18.60%、65.12%、6.98%、9.30%（圖1-C）。

2.3 不同類群性狀間平均值比較

正常鐵營養(yǎng)供應、缺鐵脅迫和脅迫指數系統(tǒng)聚類不同類群小麥品種不同性狀的平均值見表2。在正常鐵營養(yǎng)情況下，超過83.72%的品種屬于類群1、類群2等兩大類群，與其他類群相比，根系數量、根干質量和根冠比位于前2位，根系長度和地上部分干質量也表現為較高。表明這兩大類群代表了山東省品種的普遍特征，即根系數量在8～9條，主根系根長16～18 cm，根干質量主要分布在8～12 mg，地上部分干質量在42～45 mg，根冠比基本為0.2左右。類群4僅有1個品種（濟麥19），表現較為特殊，根系數量和根系長度與其他品種相當，但根干質量偏低，地上部分干質量偏高，說明該品種在苗期地上部分生長量要高于地下部分生長量。

缺鐵脅迫下，供試小麥品種則分為7個類群，品種間存在較大差異，表明在缺鐵情況下，明顯影響了品種的苗期發(fā)育。在七大類群中，前3個類群品種占總樣本的80.32%，與正常對照相比，根系數量、根系長度和根干質量相差不大，地上部分干質量有所下降，根冠比略微上升。值得注意的是，類群4的2個品種（濟南8號、煙農15）雖然根系數量增加不明顯，但根系長度、根系干質量和地上部分干質量與其他類群平均值相比表現最高，表明在缺鐵脅迫下，濟南8號、煙農15等2個品種地下部分和地上部分的生長均較為明顯，似乎并不受脅迫的影響，可理解為具有較強的耐受能力;類群6的2個品種（濟南16、菏麥19）與其他類群性狀平均值相比，除根冠比表現最高，其他4個性狀均表現最低，說明缺鐵嚴重影響了根系和地上部分的發(fā)育，根冠比較高是由于地上部分干質量顯著降低的原因所導致。

脅迫指數反映缺鐵脅迫后苗期性狀的變化。根據系統(tǒng)聚類各類群性狀的平均值，發(fā)現缺鐵脅迫后，小麥根系數量、地上部分干質量和根冠比全部為降低（負值），根系長度除類群1無變化外，類群2降低，類群3和類群4略有升高。根干質量4個類群均有不同程度的增加，以類群1和類群4升高較為明顯。

3 討論與結論

歐式距離是系統(tǒng)聚類應用最為廣泛的距離[18]，即2點之間的實際距離;卡方距離則是利用列聯表的方法得到1個卡方統(tǒng)計量來衡量2個個體之間的差異性，它被認為比歐式距離等常用的距離系數有更強的分辨能力[16]。根據本研究的數據結構計算歐式距離系數、歐式平方距離系數和卡方距離系數，利用可變類平均法可以較好地進行系統(tǒng)聚類，合適類群數目F值的概率達極顯著水平。

聚類分析的結果顯示，供試小麥品種中多數品種（超過80%）被聚為特定的2類和3類，這些品種無論在正常情況下還是在缺鐵脅迫下，各性狀的數值也較為接近，表明上述品種具有相似的發(fā)育規(guī)律和特點。而從脅迫指數可以看出，雖然被劃分為不同類群，通過平均值分析，不同類群間也具有相似的特征，即缺鐵脅迫可以影響根系數量的增加，有助于根系干物質的增加，不利于地上部分干物質的積累，對主根系的伸長則因品種而異。

然而，個別小麥品種卻具有不同的發(fā)育特點，如濟麥19，苗期地上部分的發(fā)育顯著快于地上部分的生長。這種特點在苗期表現為繁茂性較好，然而在生長后期的抗倒性能并不特別突出，可能與苗期的這種發(fā)育特點有關。濟南8號、煙農15在缺鐵脅迫下表現出較好的耐受能力，缺鐵可能會誘導體內一系列的生理生化反應，促進根系的伸長和根總量的增加來應對脅迫;而濟南16、菏麥19，在缺鐵情況下生長受到明顯抑制，根系數量的發(fā)生、主根系的伸長和干物質積累均處于較低水平，表明這2個品種對缺鐵較為敏感。

通過本研究的聚類分析，對山東省小麥品種苗期的地下部分和地上部分的生長發(fā)育有了更為清晰的了解，同時，缺鐵對小麥品種的影響也有了更為深入的認識。對缺鐵耐受的濟南8號和煙農15，可通過基因組、轉錄組和蛋白組等研究方法進一步探討缺鐵響應的分子機制;對缺鐵敏感型小麥品種如濟南16、菏麥19，在推廣種植中應避開缺鐵的干旱、半干旱地區(qū)。

綜上所述，正常鐵供應下，利用卡方距離可變類平均法可將86個小麥品種分為4個類群;缺鐵脅迫下，利用歐式平方距離可變類平均法可將其分為7個類群;對于脅迫指數，利用歐式距離可變類平均法可將其分為4個類群。缺鐵可影響小麥根系數量的增加，促進根系干物質積累，但阻礙地上部分干物質的積累。

參考文獻：

[1]Marschner H，Rmheld V，Kissel M . Different strategies in higher plants in mobilization and uptake of iron[J]. Journal of Plant Nutrition，1986，9（3/4/5/6/7）：19.

[2]Klair S，Hider R C，Adams M Z，et al. Studies of iron transport in wheat using synthetic phytosiderophores1[J]. Journal of Plant Nutrition，1996，19（8/9）：1295-1307.

[3]Mori S. Iron acquisition by plants[J]. Current Opinion in Plant Biology，1999，2（3）：250-253.

[4]Aciksoz S B，Ozturk L，Gokmen O O，et al. Effect of nitrogen on root release of phytosiderophores and root uptake of Fe（Ⅲ）-phytosiderophore in Fe-deficient wheat plants[J]. Physiologia Plantarum，2011，142（3）：287-296.

[5]Takahashi M，Terada Y，Nakai I，et al. Role of nicotianamine in the intracellular delivery of metals and plant reproductive development[J]. Plant Cell，2003，15（6）：1263-1280.

[6]Ueno D，Ma J F. Secretion time of phytosiderophore differs in two perennial grasses and is controlled by temperature[J]. Plant and soil，2009，323（1/2）：335-341.

[7]石榮麗，張福鎖，鄒春琴. 不同基因型小麥鐵營養(yǎng)效率差異及其可能機制[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學報，2010，16（6）：1306-1311.

[8]呂選忠，于 宙，王廣儀. 元素生物學[M]. 合肥：中國科學技術大學出版社，2011：403-408.

[9]Dekock P C，Hall A，Inkson R H E. Active iron in plant leaves[J]. Annals of Botany，1979，43（6）：737-734.

[10]Su L Y，Miller G W. Chlorosis in higher plants as related to organic acid content[J]. Plant physiology，1961，36（4）：415-420.

[11]Tong Y A，Fan F，Korcak R F. Effect of micronutrients phosphorous and chelator to iron ratio on growth chlorosis and nutrition of apple seedlings[J]. Journal of Plant Nutrition，1986，9（23）：1115-1132.

[12]鄒春琴，張福鎖，毛達如. 鐵對玉米體內氮代謝的影響[J]. 中國農業(yè)大學學報，1998，3（5）：45-49.

[13]沈阿林，王朝輝. 小麥營養(yǎng)失調癥狀圖譜及調控技術[M]. 北京：科學出版社，2010：36-39.

[14]蒿寶珍，李萬昌，姜麗娜，等. Fe2+對小麥籽粒萌發(fā)及幼苗鐵積累和分配的影響[J]. 江蘇農業(yè)科學，2008（3）：19-22.

[15]馬海珍. 鐵、銅復合脅迫對小麥種子萌發(fā)及幼苗生理生化特性的影響[D]. 蘭州：西北師范大學，2014.

[16]唐啟義. DPS數據處理系統(tǒng)（第二卷：現代統(tǒng)計及數據挖掘）[M]. 北京：科學出版社，2013：531-537.

[17]楚秀生，李根英，隋新霞，等. 山東小麥種質資源研究回顧與展望[J]. 植物遺傳資源科學，2001，2（4）：59-63.

[18]張善文，張晴晴，齊國紅，等. 基于改進K中值聚類的蘋果病害葉片分割方法[J]. 江蘇農業(yè)科學，2017，45（18）：205-208.