翟雪 張栩 連光倩

摘要：稻穗大小是決定水稻產(chǎn)量的重要性狀，為了挖掘與穗型相關(guān)的基因，為水稻產(chǎn)量遺傳育種研究提供理論基礎(chǔ)和應(yīng)用價(jià)值，以大穗秈稻地方品種寶大粒（BDL）和小穗粳稻品種矮格拉（AGL）為親本，構(gòu)建F2代群體，對(duì)穗型性狀進(jìn)行數(shù)量性狀座位（QTL）初步分析;根據(jù)F2群體定位結(jié)果，標(biāo)記選擇區(qū)間雜合體，自交構(gòu)建F4分離群體，驗(yàn)證QTL位點(diǎn)。結(jié)果表明，在F2群體中共檢測(cè)到與5個(gè)穗型相關(guān)性狀的6個(gè)QTLs，分別位于第2、6、7染色體上。二次枝梗數(shù)QTL qNSB7和一次枝梗數(shù)QTL qNPB7定位于第7染色體的RM542～A83區(qū)間，LOD值（表示連鎖可能性的大小）分別為10.84和5.03，分別解釋30.74%和12.34%的表型變異，并且在其相鄰的A85～A28和A83～A85區(qū)間分別檢測(cè)到每穗穎花數(shù)QTL qSNP7和穗長(zhǎng)QTL qPL7，LOD值分別為5.31和4.12，表型貢獻(xiàn)率分別為14.80%和11.82%。另外，在第2染色體上檢測(cè)到1個(gè)穗長(zhǎng)QTL qPL2，LOD值為3.76，表型貢獻(xiàn)率為9.12%;在第6染色體上檢測(cè)到1個(gè)結(jié)實(shí)率QTL qSSR6，LOD值為4.34，表型貢獻(xiàn)率為11.26%。以qNSB7為目標(biāo)QTL，在F4分離群體中進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，qNSB7仍位于RM542和A83標(biāo)記之間，LOD值為9.84，解釋了30.74%的表型變異，且其他3個(gè)QTLs qSNP7、qPL7和qNPB7都聚集在這317 kb的區(qū)間，解釋了17.2%～24.6%的表型變異。由結(jié)果可知，qNSB7是1個(gè)通過增加二次枝梗數(shù)，影響每穗穎花數(shù)、一次枝梗數(shù)和穗長(zhǎng)的一因多效新位點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：水稻;穗型相關(guān)性狀;QTL定位

中圖分類號(hào)： S511.03 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）13-0059-05

水稻是最重要的糧食作物，提高水稻產(chǎn)量成為解決未來糧食危機(jī)的重要手段，也是水稻育種和生產(chǎn)的主要目標(biāo)。影響水稻產(chǎn)量的因素很多，而單位面積產(chǎn)量可以被解析為穗數(shù)和單穗谷粒質(zhì)量，后者更具有生產(chǎn)意義。單穗谷粒質(zhì)量由每穗穎花數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒質(zhì)量3個(gè)因素構(gòu)成，增加每穗穎花數(shù)是最重要的高產(chǎn)育種方向和栽培策略。作為重要的穗部性狀，每穗穎花數(shù)與一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、穗長(zhǎng)等性狀密切相關(guān)。這些性狀在不同群體和環(huán)境中定位的數(shù)量性狀座位（QTL）結(jié)果有較大的差異，被認(rèn)為是受多基因控制的數(shù)量性狀，且受遺傳背景和環(huán)境影響[1]。目前已經(jīng)定位的有關(guān)水稻穗部性狀的QTLs有很多，不均勻地分布于水稻基因組中[2-6]。例如，Luo等利用1套以秈稻高產(chǎn)栽培品種桂朝2號(hào)為背景的普通野生稻的漸滲系，檢測(cè)到39個(gè)穗部性狀的QTLs，包括穗長(zhǎng)、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、每穗穎花數(shù)和小穗密度[7]。大多數(shù)控制穗相關(guān)性狀的QTLs都集中在同一染色體上，這就解釋了這些性狀之間的顯著相關(guān)性。

近年來，一些穗部性狀的QTLs被解析為單一遺傳因子從而得到圖位克隆。Gnla是首個(gè)被克隆的水稻穗粒數(shù)QTL，Gnla是1個(gè)與細(xì)胞分裂素氧化酶/脫氫酶高度同源的OsCKX2基因[8]。OsCKX2表達(dá)量的降低會(huì)引起花序分裂組織中細(xì)胞分裂素的積累，從而增加穎花數(shù)量，提高產(chǎn)量。DEP1是控制水稻直立穗的基因[9]，突變的DEP1通過促進(jìn)細(xì)胞分裂，使稻穗變密，枝梗數(shù)増加，穗粒數(shù)增加，而穗頸節(jié)長(zhǎng)度變短。LAX2[10]/Gnp4[11]編碼1個(gè)核蛋白，調(diào)控水稻腋生分生組織的形成。LAX2能與LAX1蛋白互作，通過調(diào)控穗型疏密程度來影響每穗粒數(shù)。OsSPL14是調(diào)控水稻株型和穗型的基因[12]，OsSPL14突變后，使水稻分蘗數(shù)減少，穗粒數(shù)、千粒質(zhì)量增加。LP（EP3）是大穗基因，編碼1個(gè)富含Kelch的F-box蛋白，集中在枝梗原基區(qū)域表達(dá)，主要調(diào)控穗型[13]。PROG1編碼1個(gè)由167個(gè)氨基酸組成的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，主要在腋芽分裂組織中表達(dá)[14]。在水稻的進(jìn)化過程中，PROG1功能喪失，由匍匐生長(zhǎng)變成直立生長(zhǎng)，株型得到改良，而且穗粒數(shù)增加，產(chǎn)量大幅度提高。SP1編碼1個(gè)可能的多肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（PTR），是控制枝梗延伸、決定穗長(zhǎng)的基因[15-16]，突變體（short panicle1，簡(jiǎn)稱sp1）稻穗變短。

本研究以大穗大粒秈稻地方品種寶大粒（BDL）和小穗粳稻品種矮格拉（AGL）為親本，通過構(gòu)建F2群體和F4次級(jí)分離群體，在第7染色體的RM542和A83區(qū)間定位并確認(rèn)了1個(gè)通過增加二次枝梗數(shù)，提高每穗穎花數(shù)，同時(shí)影響一次枝梗數(shù)、穗長(zhǎng)的一因多效QTL，為后續(xù)進(jìn)行精細(xì)定位、克隆和機(jī)制的研究提供重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究材料以大穗秈稻品種寶大粒（BDL）、小穗粳稻品種矮格拉（AGL）為親本，雜交獲得F1代，F(xiàn)1代自交獲得F2代分離群體（182個(gè)單株），用于QTL的初定位。根據(jù)F2代結(jié)果，標(biāo)記選擇目標(biāo)QTL區(qū)間雜合型F2代，種植鑒定F2 ∶ 3家系（60株）。在目標(biāo)性狀分離、其他農(nóng)藝性狀相對(duì)一致的F2 ∶ 3家系中，再次選擇區(qū)間雜合體，種植F3 ∶ 4次級(jí)分離群體，用于驗(yàn)證定位結(jié)果。2015年種植F2群體，2016年種植F3群體，2017年種植F4群體，以上群體都種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗(yàn)站，單株栽插，株距16.7 cm，行距20.0 cm，按照田間常規(guī)方法進(jìn)行種植管理。

1.2 性狀調(diào)查

在完熟期對(duì)應(yīng)DNA取樣編號(hào)進(jìn)行取樣，每株收取3個(gè)較大的稻穗（邊行和邊株不取樣），裝入紙袋，于室內(nèi)調(diào)查穗長(zhǎng)、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、每穗穎花數(shù)和結(jié)實(shí)率，將3穗平均值作為該植株表型值。取穗頸節(jié)至穗頂（不含芒）的距離為穗長(zhǎng)（精確至0.1 cm），隨后依次調(diào)查一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、每穗穎花數(shù)和結(jié)實(shí)率。穗部性狀調(diào)查后，將同一單株的種子裝回紙袋，曬干，以備后代種植。

1.3 DNA提取和PCR擴(kuò)增

在移栽定苗后的分蘗盛期，按田間材料、行、株編號(hào)，采集各單株的幼嫩葉片，同時(shí)采集親本葉片，用于提取總DNA。DNA的提取采用Dellaporta等提出的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）提取方法[17]。

PCR反應(yīng)體系：采用10 μL體系，含有1 μL DNA（20 ng/μL），各0.5 μL正反向引物（10 μmol/L），0.2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），1 μL 10×Buffer（含Mg2+），0.1 μL Taq聚合酶（2.5 U/μL），6.7 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min;95 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，32個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min;10 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）進(jìn)行檢測(cè)，銀染顯色，讀帶，用數(shù)碼相機(jī)拍照并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.4 簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，簡(jiǎn)稱SSR）的引物篩選和InDel標(biāo)記開發(fā)

SSR標(biāo)記和InDel標(biāo)記是群體遺傳作圖的標(biāo)記。SSR標(biāo)記都是公開的引物（詳見Gramene網(wǎng)站）。InDel標(biāo)記的設(shè)計(jì)依據(jù)日本晴與93-11水稻基因組序列同一座位上插入和缺失堿基的差異，采用Primer 5軟件或通過RiceVarMap（http：//ricevarmap.ncpgr.cn/）在網(wǎng)上設(shè)計(jì)引物，經(jīng)NCBI（美國國立生物技術(shù)信息中心）網(wǎng)站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）驗(yàn)證引物序列在水稻基因組中的唯一性。標(biāo)記的物理位置參照日本晴基因組序列。SSR引物和InDel引物均由南京擎科生物科技有限公司合成。涉及QTL位點(diǎn)的InDel標(biāo)記引物序列見表1。

1.5 QTL分析

用SSR引物和InDel引物對(duì)親本寶大粒與矮格拉的多態(tài)性進(jìn)行篩選，選取具有多態(tài)性且條帶清晰、易于區(qū)分的引物作為候選引物，用于后續(xù)使用。用NCBI的Primer-BLAST對(duì)候選引物進(jìn)行物理距離查詢。然后對(duì)候選引物進(jìn)行表型和標(biāo)記基因型關(guān)聯(lián)分析，并根據(jù)分子標(biāo)記所顯示的基因型，結(jié)合群體表型，采用軟件QTL IciMapping 3.30的Mapping和Bipping功能進(jìn)行遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建和QTL定位。采用完備加性區(qū)間的方法，以LOD值（表示連鎖可能性的大?。?3.0作為QTL存在的閾值，運(yùn)算1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 穗型性狀表型的鑒定

親本寶大粒（BDL）和矮格拉（AGL）的穗型差異極大（圖1-A、圖1-B）。寶大粒是一個(gè)大穗型品種，其穗長(zhǎng)為（29.3±3.7） cm，一次枝梗數(shù)為（15.3±0.9）個(gè)，二次枝梗數(shù)多達(dá)（40.3±3.7）個(gè)，每穗穎花數(shù)為（230.4±9.6）粒，結(jié)實(shí)率為（78.0±2.0）%。相反，矮格拉是一個(gè)小穗型品種，其穗長(zhǎng)僅為（14.2±1.2） cm，一次枝梗數(shù)為（5.8±0.8）個(gè)，二次枝梗數(shù)為（4.7±1.0）個(gè)，每穗穎花數(shù)為（40.2±3.7）粒，結(jié)實(shí)率為（91.1±1.0）%。由圖1-C、表2可以看出，F(xiàn)2群體的穗部性狀中，穗長(zhǎng)、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、每穗穎花數(shù)和結(jié)實(shí)率在F2群體的變異幅度分別為13.7～39.1 cm，0.7～18.7個(gè)，1.7～51.0個(gè)，36.2～270.7粒，2.70%～98.46%，說明這5個(gè)性狀在F2群體中分離明顯，但均呈正態(tài)連續(xù)分布（圖2），符合典型的數(shù)量性狀特征。

2.2 穗型相關(guān)性狀的QTL分析

利用1 300對(duì)SSR引物和InDel引物在親本寶大粒與矮格拉之間篩選多態(tài)性標(biāo)記，篩選出共顯性標(biāo)記150個(gè)，多態(tài)率僅為11.5%。從中挑選出均勻覆蓋水稻全基因組的90個(gè)標(biāo)記，用于鑒定F2群體（182株）的基因型，構(gòu)建連鎖圖，分析穗型相關(guān)的5個(gè)性狀的QTLs。

QTL分析結(jié)果顯示，共檢測(cè)到穗長(zhǎng)（PL）、一次枝梗數(shù)（NPB）、二次枝梗數(shù)（NSB）、穗粒數(shù)（SNP）和結(jié)實(shí)率（SSR）5個(gè)穗型性狀的6個(gè)QTLs（表3）。二次枝梗數(shù)QTL qNSB7和一次枝梗數(shù)QTL qNPB7定位于第7染色體的RM542～A83區(qū)間，LOD值分別為10.84和5.03，表型貢獻(xiàn)率分別為30.74%和12.34%，并且在其相鄰的A85～A28和A83～A85區(qū)間分別檢測(cè)到每穗潁花粒數(shù)QTL qSNP7和穗長(zhǎng)QTL qPL7，LOD值分別為5.31和4.12，表型貢獻(xiàn)率分別為14.80%和11.82%。即在RM542和A28之間約1 Mb的物理區(qū)間內(nèi)檢測(cè)到這4個(gè)與穗型相關(guān)的QTLs，均表現(xiàn)出正向加性效應(yīng)，即增效位點(diǎn)來自同一個(gè)親本寶大粒。這一結(jié)果與表型間高度相關(guān)的結(jié)果（表4）吻合，說明該區(qū)間存在緊密連鎖或一因多效的穗型性狀QTL。

此外，在第2染色體的InDel標(biāo)記A105和SRR標(biāo)記RM14001之間檢測(cè)到1個(gè)穗長(zhǎng)QTL qPL2，LOD值為3.76，解釋了9.12%的表型變異。在第6染色體的W45和Y48之間檢測(cè)到影響結(jié)實(shí)率的QTL qSSR6。

2.3 qNSB7位點(diǎn)的驗(yàn)證

鑒于qNSB7有較大的LOD值和表型貢獻(xiàn)率，且該區(qū)間存在其他3個(gè)相鄰穗部性狀QTLs，因此將其作為目標(biāo)QTL作進(jìn)一步研究。為了避免背景不一致而影響表型鑒定的可靠性，筆者從F2代開始連續(xù)利用連鎖標(biāo)記選擇雜合體自交，建立1個(gè)由151個(gè)植株組成的F4分離家系（編號(hào)為17-6503的家系），對(duì)F2定位結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。QTL分析顯示，qNSB7仍位于RM542和A83標(biāo)記之間，LOD值為9.84，解釋了30.74%的表型變異。并且，其他3個(gè)穗型QTLs qSNP7、qNPB7和qPL7都聚集在這個(gè)區(qū)間，解釋了17.2%～24.6%的表型變異（表5）。因此認(rèn)為，qNSB7在不同世代間可以重演，能穩(wěn)定遺傳。

以RM542標(biāo)記為參照，分析該家系不同基因型的二次枝梗數(shù)、每穗穎花數(shù)、一次枝梗數(shù)和穗長(zhǎng)的數(shù)量分布。二次枝梗數(shù)呈正態(tài)分布， 矮格拉純合基因型的二次枝梗數(shù)分布在 1.0～22.0個(gè)范圍內(nèi)，其平均值為（11.45±5.44）個(gè);寶大粒純合基因型分布在7.3～36.0個(gè)范圍內(nèi)，平均值為（21.61±7.55）個(gè);而雜合體的平均值為（18.45±8.44）個(gè)，分布范圍覆蓋了雙親基因型范圍，說明qNSB7是1個(gè)半顯性QTL（圖3）。每穗穎花數(shù)呈相似的分布特征，矮格拉純合基因型分布在 34.0～136.5粒范圍內(nèi)，平均值為（89.95±28.01）粒;寶大粒純合型分布在66.0～181.7粒范圍內(nèi)，其平均值為（124.18±30.15）粒;雜合體的平均值為（110.10±39.26）粒，分布范圍覆蓋了雙親基因型。一次枝梗數(shù)、穗長(zhǎng)的分布特征類似于上述性狀。因此可以確認(rèn)qNSB7的定位區(qū)間。由于2種純合型的表型值相互重疊，難以從個(gè)體表型值定性判斷基因型。盡管在這151個(gè)植株中有5個(gè)重組型個(gè)體，但是仍需要后代群體的平均表型值和變異度來確定基因型。

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