蔡薇 吳志鵬 趙俊生

摘要：納豆激酶（nattokinase，NK）是一種有效的抗血栓藥物?；谝褬?gòu)建的納豆激酶慢病毒表達(dá)載體，旨在比較其在雞輸卵管上皮細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞中特異性表達(dá)的有效性。提取含卵清蛋白啟動子（ovalbumin promoter，OV2）和雌激素反應(yīng)元件（estrogen response element，ERE）的pLV-OV2-ERE-NK-2A-EGFP重組質(zhì)粒。通過PCR和雙酶切進(jìn)行初步鑒定，經(jīng)生物公司測序、包裝和滴定得轉(zhuǎn)染傳代培養(yǎng)的雞輸卵管上皮細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞，并采用熒光顯微鏡和qPCR法檢測細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物。結(jié)果表明，載體pLV-OV2-ERE-NK-2A-EGFP構(gòu)建成功;且熒光顯微鏡下，雞輸卵管上皮細(xì)胞的綠色熒光多于成纖維細(xì)胞;qPCR檢測發(fā)現(xiàn)NK正常表達(dá)。提示成功構(gòu)建納豆激酶慢病毒表達(dá)載體且在雞輸卵管上皮細(xì)胞中正常表達(dá)。

關(guān)鍵詞：納豆激酶;卵清蛋白啟動子;雌激素反應(yīng)元件（ERE）;慢病毒載體;雞輸卵管上皮細(xì)胞;雞胚成纖維細(xì)胞

中圖分類號：S858.31 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0042-03

臨床上采用注射纖溶酶原激活劑的方法治療血栓和栓塞性疾病。但由于其局限性不能滿足市場需求。而之前所研究的納豆激酶（nattokinase，NK）具有很強(qiáng)的纖溶活性，能直接作用于纖溶蛋白，也能激活體內(nèi)纖溶酶原[1]，且不具有其他溶栓類藥物的缺點(diǎn)。陳寅等將NK用表達(dá)質(zhì)粒pTYB102轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2566，測定表達(dá)的NK占菌體總蛋白的30%以上[2]。黃志立等研究結(jié)果表明NK的表達(dá)率為12%，CLT法測定其具有溶栓活性，1 mL菌液的溶栓活性相當(dāng)于120 U尿激酶[3]。童煜等表達(dá)出的1 mg NK干粉的溶栓活性相當(dāng)于600 U尿激酶[4]。Hofmann等發(fā)現(xiàn)在非人類慢病毒轉(zhuǎn)染人細(xì)胞過程中，可能存在轉(zhuǎn)染效率低等問題[5]。Valori等研究表明，慢病毒（lentivirus，LV）能感染靜止細(xì)胞，不會導(dǎo)致寄主細(xì)胞死亡，且被它感染的動物細(xì)胞能夠連續(xù)傳代[6]。Kamihira等通過對慢病毒的改造，極大地增加了慢病毒載體使用的生物安全性[7]。慢病毒載體是以慢病毒基因組為基礎(chǔ)，除去其復(fù)制所需的必需基因，以具有治療性的目的基因和選擇性標(biāo)記物整合構(gòu)建而成。雞輸卵管生物反應(yīng)器可使目的蛋白在雞輸卵管中特異性表達(dá)，并且隨雞蛋排出體外[8]。卵清蛋白在雞蛋中的比重較大，雞體細(xì)胞中的基因組均含有卵清蛋白序列，由多個外顯子和內(nèi)含子組成，其中一些外顯子是構(gòu)成mRNA編碼區(qū)的重要組件[9]。在糖皮質(zhì)激素和雌激素等激素的作用下，卵清蛋白基因中的類固醇激素依賴性調(diào)控元件SDRE在雞輸卵管細(xì)胞中通過激素調(diào)節(jié)卵清蛋白基因的表達(dá)。卵清蛋白基因啟動子序列通過對卵清蛋白基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控，對卵清蛋白基因的表達(dá)量產(chǎn)生影響[10]。

本試驗(yàn)通過鑒定、包裝和滴定已構(gòu)建的納豆激酶慢病毒表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染雞輸卵管上皮細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞以研究其表達(dá)特異性，為進(jìn)一步研制NK轉(zhuǎn)基因雞奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 重組質(zhì)粒、受精雞蛋和原代雞輸卵管上皮細(xì)胞

重組質(zhì)粒pLV-OV2-ERE-NK-2A-EGFP，由浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院動物遺傳育種與繁殖實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，保存在大腸桿菌菌株DH5a。8～10日齡受精蛋，由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供;原代雞輸卵管上皮細(xì)胞，購自上海賽百慷生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑與工具酶

質(zhì)粒提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司（TIANGEN，美國）;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶、培養(yǎng)瓶和12孔培養(yǎng)板，均購自斯百匯生物技術(shù)（北京）有限公司（Gibco，美國）;SYBR GreenERTM qPCR SuperMix Universal，購自杰英生物科技（北京）有限公司（Invitrogen，美國）。

1.3 納豆激酶慢病毒載體質(zhì)粒的提取、鑒定、包裝、滴定

根據(jù)質(zhì)粒小提試劑盒（TIANGEN，美國）提取大腸桿菌菌株DH5a內(nèi)的重組質(zhì)粒pLV-OV2-ERE-NK-2A-EGFP。采用酶切與測序方法進(jìn)行鑒定。正確的質(zhì)粒送上海漢恒生物技術(shù)有限公司進(jìn)行慢病毒包裝，qPCR法測定慢病毒載體滴定。

1.4 細(xì)胞的培養(yǎng)

1.4.1 雞胚成纖維細(xì)胞的細(xì)胞原代培養(yǎng) 取受精蛋中的雞胚，采用1%青-鏈霉素（雙抗）的PBS溶液反復(fù)清洗;剪掉雞胚四肢、內(nèi)臟和頭部。將剩余組織剪碎后貼在培養(yǎng)瓶管壁上，倒置放入CO2培養(yǎng)箱;10 min后再向其中加入5 mL完全培養(yǎng)液;待組織塊完全浸潤后，繼續(xù)放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 去除培養(yǎng)瓶中原有培養(yǎng)液，采用 37 ℃ PBS溶液漂洗細(xì)胞2～3次，再加入2～3 mL 0.25%胰蛋白酶溶液，在培養(yǎng)箱中翻轉(zhuǎn)消化;待顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮變圓分散成單個細(xì)胞時加入完全培養(yǎng)液終止消化，按1 ∶ 2的比例分裝成2瓶，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 納豆激酶基因在細(xì)胞中的表達(dá)

1.5.1 納豆激酶慢病毒載體轉(zhuǎn)染 待傳代后的雞輸卵管上皮細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞密度生長至80%左右時，采用納豆激酶慢病毒表達(dá)載體pLV-OV2-ERE-NK-2A-EGFP進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以293F細(xì)胞為對照，通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

1.5.2 NK的mRNA水平檢測 提取雞輸卵管上皮細(xì)胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。采用qPCR檢測NK在細(xì)胞中的mRNA水平。以GAPDH為內(nèi)參，cDNA為模板，用Primer 5.0軟件設(shè)計并由華大基因公司合成引物。PCR反應(yīng)體系：SYBRGreenERqPCR SuperMix Universal 12.5 μL，其中 10 μmol/L 引物P1和P2各0.5 μL，cDNA 0.5 μL，DEPC-treated water 11.0 μL。PCR反應(yīng)條件：90 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃ 變性15 s，60 ℃退火1 min，75 ℃延伸10 min，共40個循環(huán)。293F細(xì)胞為對照組。

1.5.3 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒提取、酶切與測序鑒定

由圖1可知，經(jīng)試劑盒小提質(zhì)粒其長度約13 kb，重組質(zhì)粒pLV-OV2-ERE-NK-2A-EGFP進(jìn)行XmaⅠ和XhoⅠ雙酶切，得到大小約10.6、2.0 kb的2條亮帶。后者與片段NK-2A-EGFP的大小為2 077 bp相符，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 NK的測序和納豆激酶慢病毒載體的包裝、滴定

根據(jù)測序結(jié)果1 327 bp序列與GenBank公布的序列（GenBank：Ay219901）有99%同源性，可認(rèn)定NK基因片段已插入表達(dá)載體中，成功獲得納豆激酶慢病毒表達(dá)載體。qPCR法測定慢病毒載體滴度約為1.6×107 IU/mL。

2.3 雞胚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)

雞胚成纖維細(xì)胞為貼壁生長型細(xì)胞。原代細(xì)胞培養(yǎng)1 d，組織塊邊緣開始游離出少量細(xì)胞，細(xì)胞間隙較大。原代培養(yǎng)2 d，細(xì)胞生長密度可以達(dá)到70%～80%（圖2-A）。細(xì)胞在傳代過程中得到純化，且生長旺盛，形態(tài)良好（圖2-B）。

2.4 雞輸卵管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)

采用組織塊分離法培養(yǎng)16 h得到原代雞輸卵管上皮細(xì)胞，此時細(xì)胞開始貼壁生長，增殖速度比成纖維細(xì)胞慢（圖3-A）。原代培養(yǎng)2 d后，細(xì)胞呈梭長形或圓形，生長密度可高達(dá)70%左右（圖3-B）。原代培養(yǎng)5 d的輸卵管上皮細(xì)胞形態(tài)變圓，大多數(shù)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，雜質(zhì)增多，細(xì)胞生長速度明顯減慢，死亡數(shù)增多（圖3-C）。

2.5 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞鏡檢

熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，納豆激酶慢病毒載體轉(zhuǎn)染輸卵管上皮細(xì)胞48 h后出現(xiàn)綠色熒光（圖4-B），隨轉(zhuǎn)染時間的延長，具有綠色熒光的細(xì)胞越來越多，到72 h后，達(dá)到最高水平（圖4-C）。轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞48 h后未發(fā)現(xiàn)綠色熒光（圖4-A）。說明OV2在雞輸卵管上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)，初步表明納豆激酶慢病毒載體在輸卵管上皮細(xì)胞中成功表達(dá)。但與對照組293F細(xì)胞相比，雞輸卵管上皮細(xì)胞中的綠色熒光量明顯較少（圖5）。可進(jìn)一步檢測雞輸卵管上皮細(xì)胞中NK的mRNA相對表達(dá)量。

2.6 NK的mRNA水平檢測

采用qPCR法得到CT值，通過2-ΔΔCT計算出NK的mRNA相對表達(dá)量，得出雞輸卵管上皮細(xì)胞未感染組與293F細(xì)胞對照組差異極顯著（P<0.01），而與雞輸卵管上皮細(xì)胞感染組差異不顯著（P>0.05）（圖6），說明納豆激酶慢病毒載體在雞輸卵管上皮細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平量不高。

3 討論

本次試驗(yàn)設(shè)計了NK目的基因和EGFP報告基因融合在一起插入含卵清蛋白啟動子（ovalbumin promoter，OV2）和雌激素反應(yīng)元件（estrogen response element，ERE）的重組質(zhì)粒pLV-OV2-ERE-EGFP中?，F(xiàn)有的多基因共載體構(gòu)建策略包括mRNA剪切策略[11]、內(nèi)部啟動子策略、融合蛋白策略及蛋白酶策略[12]等。這些策略最主要的不足之處在于載體容納能力有限[13]。另外，多基因在同一載體上表達(dá)時其蛋白活性及表達(dá)效率不及單基因表達(dá)載體[14]。2A肽的多基因載體構(gòu)建策略避免了多基因表達(dá)時蛋白活性不高或下游基因表達(dá)量低等缺點(diǎn)[15]。Adam等用人角蛋白K14基因的啟動子替換PGK的啟動子（LVK14），后用慢病毒載體感染豬胚胎。盡管在豬所有組織中都檢測到了LVK14的整合體，但是僅在皮膚中有GFP的表達(dá)[16]。本試驗(yàn)轉(zhuǎn)染雞輸卵管上皮細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞24 h后，前者出現(xiàn)綠色熒光，而后者幾乎沒有。說明啟動子在不同種類的細(xì)胞選擇性地執(zhí)行功能，或是EGFP在不同細(xì)胞中差異性地將解，可用Western Blot進(jìn)行驗(yàn)證。納豆激酶在雞輸卵管上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的mRNA量較低，表明重組質(zhì)粒中OV2的效率較低。楊鵬翔等以EGFP和螢火蟲熒光素酶為報告基因，構(gòu)建OV2慢病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染雞輸卵管上皮細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞、鼠3T3-L1 前脂肪細(xì)胞和牛乳腺上皮細(xì)胞，通過熒光和酶活性檢測發(fā)現(xiàn)基于OV2調(diào)控序列構(gòu)建的表達(dá)載體無法實(shí)現(xiàn)外源基因的高效特異性表達(dá)[17]。Ochiai等采用OV2的5′側(cè)翼1.35 kb片段和3種不同的病毒啟動子分別構(gòu)建載體，通過基因槍的方法注射到產(chǎn)蛋母雞的輸卵管部位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒啟動子的啟動效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于OV2調(diào)控區(qū)[18]。這些都與本研究結(jié)果一致，驗(yàn)證OV2在雞輸卵管上皮細(xì)胞表達(dá)效率低。

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