修春英 ，陳 白 ，趙莉莉 ，汪 欣

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建 福州350003；2.福建省康復(fù)技術(shù)重點實驗室，福建 福州350003）

心血管疾病的發(fā)生是多種不良因素長期相互作用的結(jié)果，已成為危害人類健康、導(dǎo)致疾病和死亡的一個主要原因，而缺氧誘導(dǎo)的心肌損傷是心血管疾病的主要致病因素之一［1］。前期研究表明，針刺手厥陰心包經(jīng)穴位對急性缺氧下心功能損傷具有調(diào)節(jié)作用［2］，而 缺氧誘導(dǎo)因 子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是機體缺氧反應(yīng)中的關(guān)鍵作用因子。由此推測，手厥陰心包經(jīng)的針刺效應(yīng)可能與調(diào)控HIF-1α、VEGF相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，本研究通過建立大鼠慢性缺氧模型，觀察針刺心包經(jīng)內(nèi)關(guān)穴對HIF-1α、VEGF的影響，從而探討其療效機制，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 實驗材料

1.1 動物與分組 SD大鼠60只，體質(zhì)量160～200 g，由福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號為SCXK（閩）2012-0001。隨機分為正常對照組、模型組、內(nèi)關(guān)組，每組20只。

1.2 主要儀器與試劑 低氧混合氣體（12%O2，88%N2，福州中銘工業(yè)氣體有限公司）；Trizol Reagent（美國 Invitrogen 公司）；SYBY Premix Ex TaqTM、Prime-Script逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TakaRa公司）；大鼠VEGF定量酶聯(lián)檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；ALLEGRA 64R型臺式高速冷凍離心機（美國Beckman公司）；7500 Fast Real-Time PCR System（美國Applied Biosystems公司）；CODA型全自動酶免分析儀（美國Bio-Rad公司）；WQ-10D1型多用電子穴位測定治療儀（北京市海淀東華電子儀器廠）；1寸華佗牌一次性使用無菌針灸針 （蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。

2 實驗方法

2.1 模型建立 參照文獻［3］的造模方法，將模型組和內(nèi)關(guān)組大鼠置于低氧艙內(nèi)，持續(xù)通入低氧混合氣體（12%O2，88%N2）12 h，隨后通入空氣 12 h，連續(xù)12 d；對照組在相同的艙體內(nèi)通入空氣。低氧艙內(nèi)壓強、溫度和濕度保持一致，CO2濃度維持在0～0.8%范圍內(nèi)。

2.2 電針參數(shù) 建立模型后內(nèi)關(guān)組進行電針內(nèi)關(guān)穴干預(yù)，每日1次，每次30 min，連續(xù)5 d。疏密波，刺激頻率10／20 Hz，強度以肢體出現(xiàn)輕微顫動為度［4-5］。

2.3 觀察指標及方法

2.3.1 實時定量 PCR法檢測 HIF-1α、VEGF的mRNA表達 ① 采用Trizol法抽提大鼠心肌組織的總RNA，通過OD260／OD280值進行 RNA純度及含量的測定。取2 μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。引物序列如下：HIF-1α：上游引物5'-CAAAACACACAG CGAAGC-3'，下游引物 5'-TCAACCCAGACATATCC ACC-3'，擴增產(chǎn)物長度 473 bp；VEGF：上游引物5'-CCTTGCTGCTCTACCTCCAC-3'，下游引物 5'-ACTC CAGACCTTCGTCGTTG-3'，擴增產(chǎn)物長度 240 bp；βactin：上游引物 5'-CATCACTATCGGCAATGAGC-3'，下游引物5'-GACAGCACTGTGTTGGCATA-3'，擴增產(chǎn)物長度156 bp。② 去除基因組DNA：用DNase I消化RNA樣品，去除其中可能含有的基因組DNA。RNA純化及質(zhì)量檢測：用RNA純化試劑盒純化RNA，紫外吸收測定法測RNA濃度，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度及完整性。③cDNA合成：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。④ 實時定量PCR：將配好的混合液加到PCR Array對應(yīng)的每個孔中，然后置PCR Array于實時定量PCR儀進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min后，94℃變性30 s，62℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán)后 72℃維持5 min。數(shù)據(jù)分析：采用ΔΔCt方法，先計算每個樣本的 ΔCt，ΔΔCt＝ΔCt（組別）－ΔCt（正常對照組），最后通過2-ΔΔCt計算各組別與對照組對應(yīng)基因的表達差異。

2.3.2 ELISA法檢測VEGF蛋白的含量 將心肌組織按1∶6加入勻漿緩沖液研磨成組織勻漿，10 000 r／min離心10 min，取上清，勻漿液置-20℃冰箱貯存?zhèn)溆?。檢測方法按試劑說明書進行，用全自動酶免分析儀測定結(jié)果，檢測波長為450 nm。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布以（）表示，采用單因素方差分析，在方差齊性的情況下，兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊情況下用Dunnett’s T3檢驗。

3 結(jié) 果

3.1 3組大鼠 HIF-1α、VEGF的 mRNA表達變化比較 見表1。

表1 3組大鼠HIF-1α、VEGF的mRNA 表達變化比較（）

表1 3組大鼠HIF-1α、VEGF的mRNA 表達變化比較（）

注：與正常對照組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正常對照組模型組內(nèi)關(guān)組n 20 20 20 HIF-1α 1 1.81±0.541）3.41±0.321）2）VEGF 1 2.17±0.811）3.50±0.171）2）

3.2 3組大鼠VEGF蛋白水平變化比較 見表2。

表2 3組大鼠VEGF蛋白水平變化比較（）

表2 3組大鼠VEGF蛋白水平變化比較（）

注：與正常對照組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正常對照組模型組內(nèi)關(guān)組n 20 20 20 VEGF／（μg／L）1.80±0.19 2.25±0.271）2.61±0.251）2）

4 討 論

缺氧是臨床常見的病理類型，不僅見于傳統(tǒng)的高原環(huán)境缺氧，隨著現(xiàn)代生活方式的改變，生活中有氧運動不足再加上環(huán)境污染，人類已不知不覺處在慢性缺氧的環(huán)境中。研究表明，缺氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)與高血壓病、動脈粥樣硬化、缺血性心臟病等多種心血管疾病密切相關(guān)，并導(dǎo)致心臟受累而引發(fā)缺血性心臟病、肺源性心臟病和貧血性心臟?。?-7］。HIF-1α是目前發(fā)現(xiàn)具唯一特異在低氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧誘導(dǎo)基因的表達調(diào)節(jié)過程中起關(guān)鍵作用［8］。VEGF是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細胞生長因子，具有增加血管通透性及促進血管內(nèi)皮細胞遷移、增殖和血管形成的作用。HIF-1α能使VEGF的轉(zhuǎn)錄和表達增強，增加血管生成，使血液到達缺氧部位，從而降低因缺氧帶給機體的損傷［9］。

基于缺氧在心血管疾病過程的重要性，慢性缺氧模型成為模擬心血管疾病的常用動物模型。本研究通過持續(xù)通入低氧混合氣體的方法制備慢性缺氧的模型，結(jié)果顯示在慢性缺氧的環(huán)境中，大鼠心肌組織的HIF-1α、VEGF的mRNA的表達增加，同時VEGF的蛋白含量增加，證實了慢性缺氧下心肌組織的應(yīng)激反應(yīng)。

《靈樞·經(jīng)脈》曰：“心主手厥陰心包絡(luò)之脈，起于胸中，出屬心包絡(luò)?！苯?jīng)脈所過，主治所及，研究證實，針刺手厥陰心包經(jīng)穴位具有良好的心肌保護效應(yīng)［10］。前期研究顯示，循手厥陰心包經(jīng)取穴，電針內(nèi)關(guān)穴、天泉穴對缺氧狀態(tài)下的心功能具有良好的調(diào)節(jié)作用［2，11］。 鑒于以上的相關(guān)研究和前期研究，本研究選取內(nèi)關(guān)穴作為研究手厥陰心包經(jīng)的代表穴位。內(nèi)關(guān)穴作為手厥陰心包經(jīng)的絡(luò)穴、八脈交會穴，是臨床手厥陰心包經(jīng)治療心血管疾病最常用、最具代表意義的穴位。本研究結(jié)果顯示，針刺內(nèi)關(guān)穴能增加HIF-1α、VEGF的mRNA表達，同時心肌組織的VEGF蛋白含量也明顯升高，表明內(nèi)關(guān)穴可以通過調(diào)節(jié)對HIF-1α、VEGF的mRNA的表達，從而增加血管生成，提高機體對缺氧的耐受性，對缺氧誘導(dǎo)的心肌損傷具有保護作用。

綜上所述，針刺手厥陰心包經(jīng)內(nèi)關(guān)穴具有對抗缺氧誘導(dǎo)心肌損傷的作用，其作用機制可能與介導(dǎo)HIF-1α、VEGF的調(diào)控相關(guān)，從而為臨床應(yīng)用手厥陰心包經(jīng)防治心肌缺氧所致疾病提供部分理論依據(jù)。