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(1.山東省海洋生物研究院,山東青島 266104;2.山東省大型海藻資源保護(hù)與應(yīng)用工程技術(shù)研究中心,山東青島 266104)

銅藻(Sargassumhorneri)俗稱“丁香屋”,屬于褐藻門(Phaeophyta)褐藻綱(Phaeophyceae)墨角藻目(Fulcales)馬尾藻科(Sargassaceae)馬尾藻屬(Saragassum)[1]。銅藻為北太平洋西部特有的暖溫性海藻,在我國主要分布于遼寧、浙江、福建和廣東等沿海地區(qū)[2]。銅藻具有較高的生態(tài)價(jià)值,是構(gòu)成潮下帶海藻場的重要種類之一,可以為海洋生物如魚類、貝類等提供繁育場所[3-5]?，F(xiàn)階段銅藻研究的熱點(diǎn)主要集中在資源調(diào)查及其形態(tài)學(xué)、生活史、人工增殖和繁殖等方面,在開發(fā)利用方面的研究尚處于初級階段[6-8],因此利用率較低,銅藻含有豐富的海藻酸,含量可達(dá)22.1%,接近海帶中海藻酸鈉的含量(24.5%)[9],可以作為藻膠工業(yè)的原料。

海藻酸是細(xì)胞壁的主要填充物質(zhì),市場上多以鈉鹽出售,即海藻酸鈉(sodium alginate,AGS)[10-11],廣泛應(yīng)用于食品、紡織、橡膠、醫(yī)藥等領(lǐng)域[12]。長期以來,海帶(Saccharinajaponica)都是我國褐藻膠工業(yè)的主要原料[13],但隨著海帶價(jià)格的不斷上漲,褐藻膠加工逐漸轉(zhuǎn)向巨藻(Macrocystispyrifera)、泡葉藻(Ascophyllumnodosum)等國際原料藻[14]。目前對銅藻提取海藻酸鈉的報(bào)道,僅有王作蕓等[15]分離純化了銅藻的海藻酸鈉、褐藻淀粉等成分,但對最適的分離和純化條件未進(jìn)行深入探討;王其東等[16]應(yīng)用銅藻海藻酸鈉作為魚糜保水劑進(jìn)行魚糜產(chǎn)品的開發(fā),未涉及提取工藝。

海藻酸鈉的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝為有機(jī)體系浸泡后再消化,耗能耗水量大,溶劑排放還會造成環(huán)境危害;以往的酶解法多采用纖維素酶作為單一酶進(jìn)行酶解[17-20],成本較高,且效果不佳;復(fù)合酶法僅見田洪蕓等和李德茂等[21-22]的研究,且采用的是分步法進(jìn)行酶解。本研究以銅藻為原料,利用復(fù)合酶解法同步加入復(fù)合酶,簡化了操作流程,優(yōu)化了提取工藝,通過提取率、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變化及耗費(fèi)物料對比了傳統(tǒng)工藝和復(fù)合酶解法的差異,為銅藻資源的開發(fā)利用提供新方向,也為進(jìn)一步開發(fā)酶解法提取海藻酸鈉奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銅藻 山東榮成俚島;果膠酶((6×104U/g)、木瓜蛋白酶(80×104U/g)、纖維素酶(2×104U/g) 龐博生物工程有限公司;水解酶(20×104U/g)、纖維素酶Ⅱ(20×104U/g) 諾維信酶制劑公司;果膠酶Ⅱ(6×104U/g)、酸性蛋白酶(10×104U/g)、纖維素酶Ⅲ(20×104U/g) 隆科特酶制劑有限公司;無水碳酸鈉、鹽酸、無水乙醇、無水氯化鈣、醋酸鈣、氫氧化鈉 分析純,國藥集團(tuán)。

FW80-1粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;PHS-3E pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南省予華儀器有限公司;YLD-6000電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;S-340N型掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海藻的采集與處理 2018年5月,選擇生長旺盛、藻體完整的銅藻成體進(jìn)行采集。采集的銅藻用過濾海水洗刷干凈,60 ℃烘干,粉碎,過40目篩,裝入自封袋,置于冰箱中-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酶解法提取海藻酸鈉 按照酶解、消化、鈣析、酸化和醇沉的工藝進(jìn)行,具體如下:銅藻粉按料液比1∶20 (mg/L)加入水和一定比例的酶,調(diào)節(jié)pH、溫度,進(jìn)行酶解;加入溶液質(zhì)量2%的碳酸鈉,60 ℃保持2.5 h進(jìn)行堿消化;調(diào)pH至6～7,加入10%氯化鈣溶液,靜置0.5 h后過濾收集沉淀;沉淀加入6 mol/L的鹽酸酸化兩次,每次0.5 h,形成海藻酸;過濾收集沉淀,加入碳酸鈉中和,形成海藻酸鈉;用等體積乙醇進(jìn)行脫水,收集沉淀物放入55 ℃烘箱中烘干,稱量并檢測。

1.2.3 傳統(tǒng)工藝提取海藻酸鈉 銅藻粉以0.5%的甲醛固色4 h,之后沖洗干凈,按照1.2.2酶解法中的消化、鈣析、酸化和醇沉工藝流程進(jìn)行試驗(yàn)[23]。

1.2.4 不同酶制劑酶解效果的比較 為篩選海藻酸鈉得率較高的酶,分別加入果膠酶Ⅰ(A)、木瓜蛋白酶(B)、纖維素酶Ⅱ(C)、水解酶(D)、纖維素酶Ⅱ(E)、果膠酶Ⅱ(F)、酸性蛋白酶(G)和纖維素酶Ⅲ(H),按照各自的最佳酶解條件(見表1),料液比1∶20,酶解2 h,以海藻酸鈉得率為指標(biāo),考察不同酶制劑對得率的影響。

表1 不同酶的最佳水解條件Table 1 Optimal hydrolysis conditions of different enzymes

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 以海藻酸鈉得率為指標(biāo),分別加入水解酶和纖維素酶Ⅱ,考察酶添加量、酶解溫度、pH和時(shí)間各因素對提取率的影響。

1.2.5.1 酶添加量 分別加入銅藻干重0.6%、0.8%、1%、4%的水解酶,0.6%、0.8%、1%、4%的纖維素酶,調(diào)節(jié)pH至5.0,55 ℃酶解2 h,制備海藻酸鈉,計(jì)算得率。

1.2.5.2 酶解時(shí)間 固定酶添加量,依次為水解酶0.6%,纖維素酶Ⅱ0.6%,調(diào)節(jié)pH至4.0,55 ℃酶解30、60、90、120、150 min,制備海藻酸鈉,計(jì)算得率。

1.2.5.3 酶解溫度 固定酶添加量,依次為水解酶0.6%,纖維素酶Ⅱ0.6%,調(diào)節(jié)pH至5.0,分別置于45、50、55、60 ℃酶解2 h,制備海藻酸鈉,計(jì)算得率。

1.2.5.4 pH 固定酶添加量,依次為水解酶0.6%,纖維素酶Ⅱ0.6%,調(diào)節(jié)pH依次為4.0、4.5、5、5.5、6.0,55 ℃酶解2 h,制備海藻酸鈉,計(jì)算得率。

以上實(shí)驗(yàn)各重復(fù)3次。

1.2.6 海藻酸鈉酶解條件的正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選用水解酶:纖維素酶Ⅱ的比例(A)、時(shí)間(B)、溫度(C)、pH(D)4個(gè)因素做L9(43)正交表進(jìn)行條件優(yōu)化,最終確定酶解法的最佳工藝條件。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.7 海藻酸鈉得率的測定 準(zhǔn)確稱量海藻酸鈉提取樣品1.0 g,加入2 mol/L鹽酸30 mL,充分?jǐn)嚢韬箪o置過夜,用蒸餾水沖洗至無氯離子為止。加入0.1 mol/L醋酸鈣30 mL,充分?jǐn)嚢?反應(yīng)2 h,酚酞做指示劑,用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定[24]。

海藻酸鈉得率=(C×V×0.2160)×100%/m

式中:C為氫氧化鈉的摩爾濃度,mol/L;V為滴定消耗的氫氧化鈉體積,mL;0.2160表示0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL相當(dāng)于0.2160 g海藻酸鈉;m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.8 電鏡掃描樣品的制備 分別將經(jīng)復(fù)合酶提取法和有機(jī)試劑浸提處理后的銅藻渣用戊二醛溶液浸泡固定2 h,之后將樣本置于0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(pH7.4)中20 min,用30%～100%的酒精梯度洗脫,醋酸異戊酯置換,臨界點(diǎn)二氧化碳干燥,離子濺射噴金20 s[25],置于環(huán)境掃描電鏡下觀察放大1500倍和3000倍時(shí)藻渣形態(tài)[26]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用Origin Pro8軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶制劑的確定

選定8種酶,分別測得海藻酸鈉的得率,如圖1所示。結(jié)果表明,各種酶對銅藻均具有一定的酶解效果,海藻酸鈉的得率依次為水解酶(D)>纖維素酶Ⅱ(E)>酸性蛋白酶(G)>木瓜蛋白酶(B)>纖維素酶Ⅰ(C)>纖維素酶Ⅲ(H)>果膠酶Ⅰ(A)>果膠酶Ⅱ(F),其中水解酶(D)和纖維素酶Ⅱ(E)效果較好,海藻酸鈉得率分別為15.92%和13.26%。海藻酸主要存在于細(xì)胞壁中,而細(xì)胞壁及細(xì)胞壁間質(zhì)主要成分為果膠和纖維素[27],同時(shí)還存在大量的蛋白質(zhì)[28]。纖維素酶和水解酶(果膠酶和木聚糖酶的復(fù)合物)均能加速細(xì)胞組織的崩解,提高酶解效果,因此選擇水解酶和纖維素酶Ⅱ?yàn)榭疾鞂ο?進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 不同酶提取海藻酸鈉的效果Fig.1 Effect of different enzymes on the yield rate of AGS

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 酶添加量對得率的影響 由圖2可知,海藻酸鈉的提取率隨著水解酶添加量的增加先升高后降低,在酶添加量為0.8%時(shí),提取率最高;隨著纖維素酶Ⅱ添加量的增加,海藻酸鈉的提取率持續(xù)增加,當(dāng)酶添加量達(dá)到1%后,提取率提高減緩。酶用量過低會導(dǎo)致反應(yīng)物不能完全反應(yīng),酶用量過高則會抑制酶促反應(yīng)的發(fā)生,本試驗(yàn)條件下兩種酶的適宜添加量分別為0.8%和1%。綜合考慮,選擇水解酶∶纖維素酶Ⅱ的添加比例分別為0.8%∶1%、1%∶1%和1%∶0.8%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 酶添加量對海藻酸鈉得率的影響Fig.2 Effect of enzyme concentrations on the yield rate of AGS

2.2.2 酶解時(shí)間對得率的影響 由圖3可知,海藻酸鈉的得率隨著時(shí)間的延長呈上升趨勢,纖維素酶Ⅱ和水解酶在酶解時(shí)間達(dá)到120 min后,得率增長幅度趨于平緩。時(shí)間太短,酶活力沒有被充分利用;而時(shí)間長會導(dǎo)致部分酶失去活性,考慮到經(jīng)濟(jì)效益和提取率,酶解時(shí)間選擇90 min。正交實(shí)驗(yàn)選擇60、90和120 min三個(gè)水平。

圖3 酶解時(shí)間對海藻酸鈉得率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on the yield rate of AGS

2.2.3 酶解溫度對得率的影響 由圖4可知,纖維素酶Ⅱ和水解酶的得率隨溫度的升高呈先上升后下降的趨勢,在55 ℃時(shí),得率最高。酶解溫度過低,酶活力低;酶解溫度過高,會導(dǎo)致酶失去活性或喪失活性。綜合考慮,選擇50、55和60 ℃三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 酶解溫度對海藻酸鈉得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on the yield rate of AGS

2.2.4 pH對得率的影響 由圖5可知,水解酶和纖維素酶Ⅱ的得率分別在pH為4.5和5時(shí)達(dá)到最高。pH影響酶的穩(wěn)定性,改變pH會影響酶分子的空間構(gòu)象、基團(tuán)解離狀況、酶分子及底物的結(jié)合狀態(tài)等,從而影響酶解反應(yīng)[29]。從酶作用效果等方面綜合考慮,選擇小范圍變化的pH4.0、4.5和5.0作為三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖5 pH對海藻酸鈉得率的影響Fig.5 Effect of pH on the yield rate of AGS

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交實(shí)驗(yàn)L9(43)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiment L9(43)

從表3可以得出,影響得率的四個(gè)因素由大到小為:C>A>D>B,即溫度對得率影響最大,其次是加酶比例、pH、酶解時(shí)間,較優(yōu)水平組合為A1B2C2D3。根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果,在水解酶和纖維素酶Ⅱ比例為0.8%∶1%,pH為5,55 ℃酶解90 min的優(yōu)化條件下,重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次,測得其平均得率為24.51%±0.54%。傳統(tǒng)甲醛法制備海藻酸鈉的得率為16.71%±0.66%,復(fù)合酶法比傳統(tǒng)方法得率提高了46.7%。另外,復(fù)合酶法要優(yōu)于單酶酶解,得率分別比單一水解酶和纖維素酶提高了40.05%和84.84%。由此可見,裂解植物細(xì)胞壁需要多種酶類的共同作用。本研究采用復(fù)合酶同步加入的方法,與分步加入法相比,簡化了反復(fù)調(diào)節(jié)溫度和pH的繁瑣步驟。

2.4 電鏡觀察

與傳統(tǒng)工藝相比,酶解法能明顯提高海藻酸鈉的得率,為了進(jìn)一步解釋這一結(jié)果,通過掃描電鏡對兩種方法處理后的藻渣進(jìn)行觀察,結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同工藝處理后的藻渣微觀結(jié)構(gòu)Fig.6 The internal structure of algae residue after different treatments

經(jīng)甲醛處理的銅藻渣細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較為完整,形態(tài)變化不大,而經(jīng)酶解處理后的銅藻渣基本已觀察不到完整的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),表面呈現(xiàn)出明顯的孔洞和破碎,細(xì)胞被破壞得較為嚴(yán)重。通過二者細(xì)胞表觀結(jié)構(gòu)的比較,驗(yàn)證了復(fù)合酶提取法有利于破壞海藻細(xì)胞的表觀結(jié)構(gòu),從而促進(jìn)了酶解作用,有利于多糖的溶出,提高了海藻酸鈉的提取率。

2.5 主要物料差異分析

由表4可知,以處理銅藻量10 kg為例進(jìn)行計(jì)算:傳統(tǒng)法和酶解法后期的消化、鈣析、酸化、中和等工藝步驟相同,物料消耗相同,主要區(qū)別在前處理工藝。

表4 物料差異表Table 4 Table of matrial difference

其中,傳統(tǒng)工藝中原料加水量為250 kg(料液比為1∶25 (g/mL)),總用水量為280 kg,甲醛用量為1.25 kg(濃度一般為0.5%);酶解工藝中原料加水量為200 kg(料液比1∶20 (g/mL)),總用水量為230 kg,檸檬酸用量為0.21 kg,酶用量為0.18 kg。其他物料用量兩種方法基本相同。

兩種方法的主要物料差異:傳統(tǒng)法甲醛用量1.25 kg,用水量比酶解法多50 kg;酶解法酶用量0.18 kg,檸檬酸鈉用量0.21 kg,海藻酸鈉產(chǎn)量比傳統(tǒng)法多0.78 kg。

兩種方法的主要物料成本差異:傳統(tǒng)法中甲醛1.25 kg×28元/kg=35元;酶解法中檸檬酸0.21 kg×40元/kg=8.4元,酶制劑0.18 kg×300元/kg=54元。兩種方法得到的產(chǎn)品海藻酸鈉價(jià)格差為(2.45-1.67) kg×300元/kg=234元。酶解法比傳統(tǒng)法多得到234-(54+8.4-35)=206.6元,多消耗的成本僅相當(dāng)于新增產(chǎn)出的(54+8.4-35)/206.6=13.26%。同時(shí)酶解法減少了稀釋用水量和工業(yè)廢水的排放量,綜上可以看出酶解法要優(yōu)于傳統(tǒng)法。

3 結(jié)論

酶解法有效破壞了銅藻細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu),促進(jìn)了多糖的溶出,提高了海藻酸鈉的得率。通過正交試驗(yàn),得到最佳提取工藝為:水解酶添加量0.8%、纖維素酶Ⅱ添加量1%,pH為5的條件下,55 ℃酶解120 min,通過消化、脫色、鈣析、酸化和醇沉等工藝制備海藻酸鈉,得率可達(dá)到24.51%±0.54%,較傳統(tǒng)工藝提高了46.7%,為銅藻的高值化加工提供有效的技術(shù)途徑。要實(shí)現(xiàn)海藻酸鈉的酶解制備的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn),還需要進(jìn)一步研發(fā)高活性、高純度的酶制劑,以降低酶用量,提高酶解效能,從而達(dá)到降低成本,提高生產(chǎn)能力的目的。