楊新根，張育平，郭紅芳，張建珍,4，武振榮，王庭林，鄒 波，常文英，侯 玉

（1.山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所，山西太原030006；2.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，山西太原030031；4.農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理山西省重點實驗室，山西太原030031；5.太原師范學(xué)院生物系，山西太原030031；6.五臺縣林業(yè)工作站，山西五臺035500）

1991 年，MOORE 等[1]提出了微衛(wèi)星DNA（Microsatellite DNA）的概念，即SSR（Simple Sequence Repeats）位點，是一類由1～6 個核苷酸為重復(fù)單位組成的長達(dá)200～800 bp 的核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列。微衛(wèi)星位點中大量重復(fù)的部分很可能存在變異，變異會表現(xiàn)為數(shù)目的整倍性不同或序列的不完全相同，因而造成位點的多態(tài)性。而揭示這些變異，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)不同的SSR 在不同的種甚至不同個體間的多態(tài)性，是SSR 標(biāo)記技術(shù)的目的。特定的微衛(wèi)星側(cè)翼序列通常保守性較強(qiáng)，故將側(cè)翼DNA 片段克隆、測序，再以人工合成引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，從而將單個微衛(wèi)星位點擴(kuò)增出來。由于SSR 存在數(shù)量上的變異，因此擴(kuò)增產(chǎn)物具有多態(tài)性，不同的等位基因由不同長度代表[2]。

由于單個SSR 位點的兩側(cè)序列通常都是保守的單拷貝序列，因此近年來大量科研工作者利用SSR 標(biāo)記技術(shù)研究物種多樣性及其分子進(jìn)化水平等。郭頌等[3-4]曾應(yīng)用13 個SSR 位點對黃胸鼠在國內(nèi)的遺傳多樣性、遷移特性及其進(jìn)化水平進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，鐵路、公路等重要交通線路及發(fā)達(dá)的物流網(wǎng)可能是加劇黃胸鼠向我國北方擴(kuò)散的主要原因；黃愛軍等[5]曾通過篩選SSR 位點，分析我國境內(nèi)亞洲韌皮部桿菌（Candidatus Liberibacter asiaticus）的群體結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，其可能存在2 種不同的群體結(jié)構(gòu)；NORRIS 等[6]利用15 個微衛(wèi)星標(biāo)記分析了來自愛爾蘭和挪威的大西洋鮭3 個養(yǎng)殖種群和4 個野生種群的遺傳多樣性，結(jié)果表明，野生種群多態(tài)性高于養(yǎng)殖種群。

長尾倉鼠（Cricetulus longicaudatus）屬于嚙齒目（Rodentia）倉鼠科（Cricetidae）倉鼠屬（Cricetulus），在我國主要分布在河北、山西、內(nèi)蒙古、陜西、甘肅、青海、新疆、西藏、四川等地。長尾倉鼠一般棲息于海拔較高的次生闊葉林地帶以及較干燥的荒地、灌草叢和農(nóng)田等。據(jù)山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所調(diào)查數(shù)據(jù)，在山西省，長尾倉鼠是大部分農(nóng)田（晉城、臨汾、長治、呂梁、晉中、太原、忻州等地）的優(yōu)勢鼠種[7-9]，有些區(qū)域（晉中、太原、忻州等地）其所占比例達(dá)70%以上，是制約山西省農(nóng)業(yè)健康發(fā)展的重大害鼠。

本研究利用從山西省11 個地市共計13 個縣（市）野外捕捉的長尾倉鼠為試驗材料，通過提取其基因組DNA，利用近源種黑線倉鼠（Crietulus barabensis）的6 對SSR 位點引物（已登記在GeneBank）對長尾倉鼠基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[10]，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）[11]，旨在通過篩選長尾倉鼠SSR 位點，摸索其擴(kuò)增條件，為今后長尾倉鼠的遺傳多樣性分析提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 動物材料 在野外捕獲活體長尾倉鼠后，取其尾尖為DNA 提取材料。捕獲地及數(shù)量見表1。

表1 試驗鼠捕獲地及數(shù)量統(tǒng)計

1.1.2 試劑 血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司），2×Taq PCR MasterMix 酶（天根生化科技有限公司），ddH2O，瓊脂糖，1×TAE，30%聚丙烯酰胺（生工生物工程股份有限公司），5×TBE，過硫酸銨，TEMED，GeStain 染液（全式金有限公司），NaCl。

1.1.3 儀器 電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；微型高速離心機(jī)Centrifuge 5424（北京伯樂生命科學(xué)發(fā)展有限公司）；瓊脂糖凝膠電泳槽（北京六一儀器廠）；聚丙烯酰胺凝膠電泳槽（北京六一儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)（Alphalmager HP）；G1000 基因擴(kuò)增儀（杭州博日科技有限公司）；DNA定量儀NANODROP 2000（賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 試驗所采用的引物借鑒了與長尾倉鼠同屬的黑線倉鼠SSR 位點引物[10-12]，并由生工生物工程股份有限公司合成。具體序列以及特點列于表2。

表2 微衛(wèi)星序列引物及特點

1.2.2 長尾倉鼠基因組DNA 的提取 采集長尾倉 鼠尾尖作為DNA 提取材料，用DNA 提取試劑盒提取基因組DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測有目標(biāo)條帶后，對其進(jìn)行定量分析。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)體系如表3 所示。

表3 PCR 反應(yīng)體系

PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，退火（引物不同溫度則不同）；72 ℃延伸30 s，34 個循環(huán)；72 ℃5 min。采用2%瓊脂糖凝膠檢測是否具有目標(biāo)條帶。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 制備8%聚丙烯酰胺凝膠檢測PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，使用170 V 恒壓，根據(jù)條帶大小設(shè)置不同時間。加入配置好的GelStain染液，室溫放置搖床1 h。觀察結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 提取與檢測

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 含量和質(zhì)量，DNA 提取結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定觀察結(jié)果如圖1 所示，質(zhì)量較好。經(jīng)DNA 定量分析，其濃度平均達(dá)到1.8 ng/μL，表明濃度足夠，符合進(jìn)行SSR 位點擴(kuò)增的試驗要求。

2.2 SSR 位點篩選

應(yīng)用與長尾倉鼠同屬的黑線倉鼠SSR 引物擴(kuò)增后的電泳結(jié)果顯示（圖2），引物SSRf6 的擴(kuò)增結(jié)果（F）不明顯，長尾倉鼠很可能不存在這一位點，其他5 個位點表現(xiàn)的多態(tài)性都較好。

3 討論

非變性聚丙烯酰胺凝膠具有很高的分辨力，能很好地分離小片段DNA（5～500 bp），甚至可以分離相差1 bp 或分離單堿基突變所引起的不同片段。但不同濃度會影響擴(kuò)增條帶的清晰度。本研究為了確定分離片段所需最適聚丙烯酰胺的濃度進(jìn)行了預(yù)試驗，分別測試了8%，10%，12%的聚丙烯酰胺凝膠[11]，從預(yù)試驗結(jié)果來看，8%的聚丙烯酰胺凝膠帶型最整齊且雜帶少，便于觀察分析試驗結(jié)果。

SSR 位點在基因組中存在的數(shù)量多，分布廣泛，與生物上其余的分子標(biāo)記方式對比，SSR 標(biāo)記的優(yōu)點主要表現(xiàn)在：數(shù)量十分豐富，整個基因組可以被覆蓋，具有高度的多態(tài)性；由于多等位基因的特性而含有的信息量高；以孟德爾方式遺傳，呈共顯性；單個位點由人工引物順序決定，便于學(xué)術(shù)上的交流合作，有利于引物的開發(fā)[2]。因此，不少科研工作者把SSR 應(yīng)用于遺傳多態(tài)性、遺傳進(jìn)化、品種鑒定、遷移和基因流等研究中，并取得了一系列的研究成果，但將SSR 應(yīng)用于長尾倉鼠的研究很少[4-6，12-14]。本研究對長尾倉鼠SSR 位點的篩選和擴(kuò)增進(jìn)行了探索，為今后長尾倉鼠的遺傳多樣性分析提供了一定的理論基礎(chǔ)。

各物種SSR 位點的獲得和篩選需要很長的過程，且費用昂貴。據(jù)有關(guān)報道，SSR 位點可通過以下途徑獲得：從研究對象的基因組中直接分離獲得；從已有的數(shù)據(jù)庫（如GenBank）中查找該物種或近緣物種的微衛(wèi)星位點，或者通過近緣物種的基因組設(shè)計微衛(wèi)星引物來擴(kuò)增研究對象的基因組[3]。本研究應(yīng)用與長尾倉鼠同屬的黑線倉鼠SSR 位點引物擴(kuò)增，其中，5 個位點表現(xiàn)的多態(tài)性都比較好，表明對于近源物種來說，大部分序列是保守的，可以借鑒近源種已探究出的引物來擴(kuò)增，可節(jié)約大量時間以及經(jīng)費[15]。本研究結(jié)果對應(yīng)用SSR 位點進(jìn)行研究提供了一定的理論基礎(chǔ)，但對于山西省長尾倉鼠的遺傳多樣性仍需進(jìn)一步分析。