邢廣旭，焦文強(qiáng)，劉運(yùn)超，王治方，王克領(lǐng)，徐引弟，李海利，張改平

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點(diǎn)實驗室，河南鄭州450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州450002；3.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實驗室，河南鄭州450002）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）感染豬引起的一種高度接觸性腸道傳染性疾病，臨床主要表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉，最后脫水死亡。該病可感染各年齡階段的豬，7 日齡尤其是3 日齡以內(nèi)的哺乳仔豬發(fā)病后死亡率最高可達(dá)100%[1]。該病在1971 年由英國首次報道[2]，并且迅速傳播到歐洲其他國家，并在比利時流行期間被證實其病原為PEDV，給歐洲的養(yǎng)豬業(yè)帶來了重大損失[3]。亞洲的日本、韓國、泰國等國家都曾先后報道過PED 的流行[4-8]。我國學(xué)者宣華等[9]于1984 年首次報道PEDV 在我國豬場的存在，并且在2010 年以前主要是以散發(fā)為主。但是從2010 年10 月開始，我國南部多省份暴發(fā)了仔豬嚴(yán)重腹瀉，并迅速蔓延到全國多個省份和地區(qū)，測序結(jié)果證明，PED暴發(fā)是由變異的PEDV 引起[10-12]；2013 年5 月，美國暴發(fā)了PED 疫情，并很快蔓延到美國全國，其分離株與我國安徽分離株（AH20122）親緣關(guān)系最為接近，表明PEDV 突變重組現(xiàn)象非常嚴(yán)重，同時這也是現(xiàn)有疫苗難以提供免疫保護(hù)的主要原因[13]。

PEDV 屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus），核酸類型為單股正鏈RNA[14]?；?組 由5′非 編碼 區(qū)（untranslated region，UTR）、3'UTR 以及7 個開放閱讀框（open reading frames，ORFs），分別編碼3 個非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structural proteins，NSPs）和4 個結(jié)構(gòu)蛋白（structural proteins，SPs）組成，也就是S 蛋白、E 蛋白、M 蛋白和N 蛋白[15]。其中，N 蛋白是所有結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)中含量最多的蛋白，在PEDV 感染早期機(jī)體會產(chǎn)生大量針對N 蛋白的抗體，因此，N 蛋白被用于早期診斷[16]。N 蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫過程中扮演著非常重要的角色[17]。此外，N 基因參與病毒基因組的轉(zhuǎn)錄、病毒核衣殼的形成以及病毒RNA 的包裝[18-19]。

為深入了解PEDV 在我國遺傳變異的情況，本研究對2014 年10 月至2018 年3 月采集到的205 份PEDV 疑似病料進(jìn)行RT-PCR 檢測，擴(kuò)增陽性樣品的N 基因序列并進(jìn)行測序，旨在為指導(dǎo)臨床PEDV的防控工作提供參考。

1 材料和方法

1.1 病料采集

本研究于2014 年10 月至2018 年3 月共采集來自河南、河北、山東、山西等地區(qū)疑似PEDV 病料205 份，包括仔豬小腸組織、糞便以及母豬血液等。

1.2 主要試劑

Taq DNA聚合酶、鼠源反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）、RNA酶抑制劑、pMD18-T Simple 載體、DL2000 Marker RNA 提取試劑盒，均購自大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖購自O(shè)xoid 公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計

參考GenBank 中收錄的PEDV 毒株N 基因序列，使用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物，上游引物為：5′-TACGGATCCATGGCTTCTGTCAGC-3′，下游引物為：5′-TCGCTCGAGTTAATTTCCTGTATC-3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 PEDV 的N 基因的克隆與測序

按照寶生物RNA 提取試劑盒操作說明書完成疑似樣品的RNA 提取，隨即合成cDNA，反應(yīng)體系為：5×NLV 反轉(zhuǎn)錄緩沖液2 μL，dNTP 2 μL，MLV 反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，rNAse 抑制劑0.3 μL，總RNA4.9 μL，充分混勻后置離心機(jī)瞬時離心混勻，42 ℃1.5 h，70 ℃10 min。以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：Taq DNA 聚合酶1 μL，cDNA 1 μL，上下 游 引 物 各1 μL，dNTP 4 μL，10×PCR Buffer（Mg2+plus）5 μL，無菌雙蒸水補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃1 min，35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后取5 μL PCR 產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，回收與預(yù)期大小一致的PCR 產(chǎn)物，并與pMD18-T simple 載體連接，4 ℃過夜后轉(zhuǎn)化至JM109 感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選后挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV 的N 基因的擴(kuò)增

205 份待檢樣品中，有191 份樣品檢測為PEDV 陽性，陽性率高達(dá)93.17%。從圖1 可以看出，PCR 擴(kuò)增PEDV N 基因的引物可以擴(kuò)增出1 326 bp大小的片段，片段符合預(yù)期大小。

2.2 PEDV 的N 基因比對結(jié)果

本研究得到的19 株N 基因序列與國內(nèi)外參考毒株進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)這19 株N 基因序列與國內(nèi)外代表毒株相比，其核苷酸的同源性為94.8%～99.5%（圖2），氨基酸的同源性為95.0%～99.3%（圖3）。

2.3 PEDV 的N 基因的進(jìn)化分析

使用MEGA 5.0 軟件，將本研究得到的19 株P(guān)EDV 的N 基因序列與GenBank 中下載的序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）。從圖4 可以看出，本研究得到的19 株P(guān)EDV 的N 基因序列與CV777、LZC、SM98、CH-S 和DR13 等毒株不在同一個分支上，表明這19 株N 基因序列與傳統(tǒng)經(jīng)典毒株進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)；而CH-HENWZ-2015、CH-HENPY-2014、CH-HENZMDPY-2017 3 株序列形成一個分支，為G2b 亞群；其余16 株N 基因序列形成另外一個分支，為G2a亞群。表明N 基因進(jìn)化趨勢日益復(fù)雜，需要加強(qiáng)此方面的監(jiān)控。

3 結(jié)論與討論

通過RT-PCR 方法，本研究得到了19 株P(guān)EDV 的N 基因序列，與先前的報道一致。本研究得到的PEDV 的N 基因由1 326 個核苷酸組成，共編碼441 個氨基酸，分子量為56 ku 左右，沒有任何堿基的缺失和插入。有研究顯示，PEDV 基因組有4 個超變區(qū)[20]，其中，V4 位于N 蛋白內(nèi)，這與以前的結(jié)論不一致[21]。

本研究得到的19 株P(guān)EDV 的N 基因序列與GenBank 中下載的參考序列核苷酸的同源性為94.8%～99.5%，氨基酸的同源性為95.0%～99.3%?？紤]到本研究所采集的樣品來自河南、河北、山西、山東、湖北、甘肅、江西、上海等多個省市，并且本研究所采集的樣品一共205 份，樣本數(shù)量足夠大，而且檢測出191 份PEDV 陽性樣品，所以，不管是樣品的采集數(shù)量還是樣品的覆蓋面積，均具有較強(qiáng)的說服力，證明N 基因是PEDV 基因組中很保守的一個結(jié)構(gòu)蛋白。氨基酸比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究得到的19 株N 蛋白氨基酸序列主要發(fā)現(xiàn)以下位點(diǎn)的突變：K123-N123，A142-T142，R241-K241，K252-R252，N255-S255，M394-T394，E400-D400，A408-L408，V402-S402，從而從氨基酸水平證實N 基因缺失很保守。

采用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建的基于N 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)本研究得到的19 株N 基因序列與CV777、LZC、SM98、CH-S 和DR13 等國內(nèi)外代表性毒株不在同一個分支上，表明這19 株N 基因序列與傳統(tǒng)經(jīng)典毒株進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)；其中，16 株N 基因序列與MN、USA-Indiana-2013、USA-Iowa107-2013、HRS-1、KGW-1、CH-ZMDZY-11 形成一個分支，為G2a，CH-HENWZ-2015、CH-HENPY-2014、CHHENZ-MDPY-2017 這3 株序列形成另一個分支，為G2b。綜上所述，表明我國目前PEDV 的N 基因與以往流行的經(jīng)典毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，大部分毒株與目前國內(nèi)外分離的毒株在一個進(jìn)化分支中，部分毒株獨(dú)立進(jìn)化成一個分支。表明PEDV 遺傳進(jìn)化趨勢日益復(fù)雜，需要長期監(jiān)控。