崔芬芬，陳 亮，曹亞萍，王勇飛，喬永剛，宋 蕓

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

苦參（Sophora flavescens Ait.）是一種多年生落葉亞灌木或草本的豆科槐屬植物[1]，是常用的傳統(tǒng)中草藥，傳統(tǒng)中藥材以其干燥根入藥，具有清熱、燥濕、殺蟲(chóng)、利尿等功效[2]；苦參作為一種常用中藥材，在許多國(guó)家包括我國(guó)、日本、韓國(guó)、印度和一些歐洲國(guó)家等都廣泛使用[3]，在我國(guó)各地均有分布[4]?？鄥⒌闹饕瘜W(xué)成分為生物堿和黃酮類化合物兩大類[5]，其具有良好的抗菌生物活性[6]、抗血管生成[7]、抗腫瘤[8]、抗炎[9]和酪氨酸酶抑制作用[10]。另外，還對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抑制作用[11]，作為植物殺蟲(chóng)劑具有良好的效果[12]。

苦參在中藥學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域中都具有重要的地位，以往其化學(xué)成分和生物堿的分離提純及藥理作用是研究的熱點(diǎn)[13]，但是對(duì)其解剖結(jié)構(gòu)方面的研究和認(rèn)識(shí)仍然是不全面的。目前，市場(chǎng)對(duì)苦參的需求量日益增加，但野生資源已無(wú)法滿足市場(chǎng)需求，因此苦參的人工栽培具有十分廣闊的前景?？鄥⒌娜斯ぴ耘嘀饕苑N子繁殖為主，但苦參種子具有高硬實(shí)性、低發(fā)芽率，導(dǎo)致苦參幼苗的嚴(yán)重短缺，這已成為阻礙苦參規(guī)范化、規(guī)?；耘嗟恼系K。

苦參具有硬實(shí)性，盡管引入“硬實(shí)”這一術(shù)語(yǔ)已超過(guò)100 a，但關(guān)于種子硬實(shí)性的研究仍有一定的不完善性和局限性[14]，硬實(shí)抑制種子的大規(guī)模生產(chǎn)和種植[15]，但目前關(guān)于硬實(shí)性的研究較少，僅在大豆等少量物種上有研究[16]。硬實(shí)性主要是由于種皮的限制引起的，種皮能夠?qū)?nèi)部物質(zhì)與外部環(huán)境分隔開(kāi)來(lái)，有利于種子的形態(tài)建成以及對(duì)于外界不良環(huán)境的抵抗，同時(shí)種皮也是外界化合物吸收進(jìn)入種子的第一道屏障[17]。

為探索苦參種子硬實(shí)性形成的原因及生長(zhǎng)過(guò)程中種皮的變化，利用石蠟切片技術(shù)從解剖學(xué)層面對(duì)苦參種子及不同發(fā)育時(shí)期的種皮解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，以研究種子結(jié)構(gòu)及種皮結(jié)構(gòu)的變化，從而為苦參種子硬實(shí)性的鑒定與探索硬實(shí)性形成的原因提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

收集山西和內(nèi)蒙古共6 份苦參種子，選擇籽粒飽滿無(wú)蟲(chóng)害的苦參種子備用；并取山西太谷的成熟種子及不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的新鮮種子，獲得其種皮備用，取材從開(kāi)花當(dāng)天起每周取一次，直至成熟。

1.2 方法

1.2.1 種子硬實(shí)率的測(cè)定 將經(jīng)過(guò)挑選后的苦參種子每份隨機(jī)挑選3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50 粒，在室溫條件下浸泡24 h，統(tǒng)計(jì)吸脹和未吸脹的種子數(shù)量，計(jì)算硬實(shí)率[18]（未吸水膨脹的種子）。

硬實(shí)率＝未吸脹種子數(shù)/供試種子數(shù)×100% （1）

1.2.2 種子石蠟切片制作方法 試驗(yàn)采用常規(guī)制片技術(shù)中最為廣泛的石蠟切片法[19]制作切片。利用FAA 固定液對(duì)材料進(jìn)行固定，抽氣下沉后于4 ℃保存過(guò)夜。用蒸餾水多次沖洗，洗去固定液后開(kāi)始脫水，利用不同濃度梯度的乙醇順濃度梯度進(jìn)行脫水，并利用番紅O 進(jìn)行染色。使用體積分?jǐn)?shù)比為1∶1 的無(wú)水乙醇與二甲苯的混合液以及二甲苯溶液對(duì)材料進(jìn)行透明，透明后對(duì)其進(jìn)行浸蠟并包埋。然后，使用YD-1508R 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)對(duì)包埋好的材料進(jìn)行切片，切片厚度為8 μm。將切片干燥后利用二甲苯溶液及無(wú)水乙醇和二甲苯的混合液對(duì)其進(jìn)行脫蠟、透明，然后利用不同濃度梯度的乙醇溶液逆濃度梯度進(jìn)行復(fù)水，并利用甲苯胺藍(lán)再次染色。最后，再次透明后利用封片劑封固。利用光學(xué)顯微鏡OLYMPUS BX51 觀察，拍照并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦參種子硬實(shí)率統(tǒng)計(jì)

對(duì)6 個(gè)種源的苦參種子硬實(shí)率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1 所示，苦參種子具有很高的硬實(shí)性，6 個(gè)種源的硬實(shí)率都超過(guò)93%，其中，內(nèi)蒙古赤峰和山西土河坪的硬實(shí)率最，均達(dá)98.7%；山西太谷的硬實(shí)率最低，為93.3%。

2.2 苦參種子的解剖結(jié)構(gòu)特征

2.2.1 種臍的解剖特征 圖2-b 所示為苦參種子的種臍部位，在種臍部位可以觀察到兩側(cè)的株柄殘余物及處于中間部位的維管系統(tǒng)。與珠柄殘余物緊密相連的是致密且整齊排列的柵欄組織細(xì)胞層。珠柄殘余物木質(zhì)化后中間凹陷形成的縫隙為苦參種子的臍縫，在臍縫的下方是發(fā)達(dá)的維管系統(tǒng)，并且在柵欄組織細(xì)胞層下方分布有大量的石細(xì)胞。

2.2.2 種皮的解剖特征 苦參種子的種皮堅(jiān)硬且致密。從圖2-c 可以看出，苦參種皮由外至內(nèi)依次是：角質(zhì)層、柵欄組織、骨狀石細(xì)胞、厚壁細(xì)胞及薄壁細(xì)胞。處于最外層的是角質(zhì)層，主要起保護(hù)作用，是連續(xù)的長(zhǎng)帶狀細(xì)胞，均勻地分布在種皮的最外層；與角質(zhì)層緊密相連的是柵欄組織，其有利于物質(zhì)的進(jìn)出，由數(shù)層細(xì)長(zhǎng)的長(zhǎng)圓柱形細(xì)胞組成，排列緊密，呈柵欄狀，與表皮細(xì)胞垂直；位于柵欄組織后的是骨狀石細(xì)胞，由厚壁組織發(fā)育而來(lái)，該細(xì)胞兩端稍膨大，形成“工”字形，由單層細(xì)胞組成，在細(xì)胞間存在很大的細(xì)胞間隙，主要起機(jī)械支持和保護(hù)作用；厚壁細(xì)胞是由多層呈橫向排列的細(xì)胞組成，起支持作用；最后是薄壁細(xì)胞，是由一系列較小的不均勻排列的網(wǎng)狀細(xì)胞組成。

2.2.3 子葉的解剖特征 圖2-d 所示為苦參橫切面的子葉部分，從圖2-d 可以看出，子葉中的葉肉細(xì)胞整齊排列，子葉細(xì)胞中含有大量的淀粉粒，其 為種子的萌發(fā)提供，重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

2.3 不同發(fā)育時(shí)期種皮解剖特征的比較

對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的種皮進(jìn)行解剖分析，結(jié)果如 圖3 所示，隨著苦參種子的不斷發(fā)育，種皮結(jié)構(gòu)也發(fā)生了變化，在開(kāi)花后第2 周，主要以角質(zhì)層、柵欄組織、厚壁細(xì)胞為主，骨狀石細(xì)胞還未分化出現(xiàn)；柵欄組織層較薄，規(guī)則的長(zhǎng)矩形形狀，排列緊密。在開(kāi)花后第3 周，在柵欄組織下可見(jiàn)一層細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，由圓形細(xì)胞向矩形狀態(tài)轉(zhuǎn)變，且排列變得緊密，骨狀石細(xì)胞已開(kāi)始分化；柵欄組織排列緊密，細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始變化，形狀變得狹長(zhǎng)。在開(kāi)花后第4 周，已明顯看出骨狀石細(xì)胞的形態(tài)，細(xì)胞伸長(zhǎng)，已具有骨狀石細(xì)胞的形態(tài)；柵欄組織形態(tài)進(jìn)一步細(xì)長(zhǎng)變化。在接下來(lái)的第5 周，骨狀石細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，開(kāi)始兩端膨大，形成“工”字。之后隨著種子的發(fā)育，骨狀石細(xì)胞膨脹成型，細(xì)胞間隙增大，柵欄組織密度增加，排列緊密。

從圖4 可以看出，隨著種子的不斷發(fā)育，種皮的厚度顯著增加，在開(kāi)花后第5 周時(shí)達(dá)到峰值，隨著時(shí)間的推移，種子后期逐漸脫水成熟，種皮厚度降低，但逐漸趨于穩(wěn)定。

由圖5 可知，隨著種子的發(fā)育，柵欄組織在種皮中所占的比例顯著增加，在開(kāi)花后第10 周即成熟時(shí)達(dá)到最高。

2.4 不同發(fā)育時(shí)期種臍解剖特征的比較

對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的苦參種臍結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖6 所示，在種子發(fā)育的第2 周時(shí)，苦參種臍有珠柄殘余物但中間還未形成凹陷，細(xì)胞聚積在一起已初現(xiàn)維管系統(tǒng)形態(tài)；第3 周時(shí)，珠柄殘余物中間形成凹陷，排列致密的柵欄組織與其緊密相連；在第4 周時(shí)，種臍已發(fā)育完全，珠柄殘余物、維管系統(tǒng)等結(jié)構(gòu)已出現(xiàn)；在之后的發(fā)育過(guò)程中，種臍結(jié)構(gòu)基本不再發(fā)生變化。說(shuō)明在種子發(fā)育早期種臍結(jié)構(gòu)已發(fā)育完全。

3 討論

硬實(shí)性是一種常見(jiàn)的休眠方式，大部分的豆科植物都有硬實(shí)性。本研究對(duì)苦參的硬實(shí)性檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，苦參具有很高的硬實(shí)性，6 個(gè)種源的硬實(shí)率高于93%。硬實(shí)性主要是由于種皮的不透性造成的，種皮的結(jié)構(gòu)致密，表面有角質(zhì)層或者蠟質(zhì)沉積物，從而使得種子表皮不透水。對(duì)苦參種子進(jìn)行石蠟切片后發(fā)現(xiàn)，苦參種子與大豆種子結(jié)構(gòu)相似[20]，主要由種皮、種臍及子葉等結(jié)構(gòu)組成，而種臍部位的珠孔與黃柏種子等相同，均由珠柄殘余物等組成[21]?？鄥⒎N皮結(jié)構(gòu)復(fù)雜，王書(shū)運(yùn)等[22]在1993 年對(duì)幾種豆科植物進(jìn)行研究指出，豆科植物的種皮結(jié)構(gòu)與禾本科相比更為復(fù)雜。研究苦參種皮解剖結(jié)構(gòu)后發(fā)現(xiàn)，苦參種皮由角質(zhì)層、柵欄組織、骨狀石細(xì)胞、厚壁細(xì)胞以及薄壁細(xì)胞等組成[23]，種皮結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有典型的豆科種皮結(jié)構(gòu)特征。

角質(zhì)層不透水、不透氣，并且對(duì)胚存在機(jī)械阻礙作用，降低了種子的發(fā)芽率[24]。有一些學(xué)者認(rèn)為，柵欄層是影響硬實(shí)的主要因素，如同在其他豆科植物中觀察到的一致[25-27]，野生大豆種皮的柵欄層與栽培型大豆相比更厚[28]。姜華等[29]對(duì)田菁種皮結(jié)構(gòu)與其滲透性之間的關(guān)系進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，限制水分進(jìn)入種皮的主要屏障是存在于種皮的柵欄層。徐亮等[30]用酸對(duì)野生大豆種子進(jìn)行處理后發(fā)現(xiàn)，柵欄層結(jié)構(gòu)基本保持完整以阻礙水分的吸收，說(shuō)明柵欄層是引起種皮不透水的主要原因。

本研究對(duì)不同時(shí)期苦參種子的種皮結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，隨著種子的發(fā)育，種皮的厚度不斷增加，柵欄組織在種皮中所占的比例逐漸增加。柵欄組織的結(jié)構(gòu)致密，沒(méi)有細(xì)胞間隙，從而增加了種皮的硬度，因此柵欄組織對(duì)種皮不透性具有重要的作用。角質(zhì)層和柵欄組織排列非常致密，而骨狀石細(xì)胞和厚壁細(xì)胞等隨著種子的發(fā)育排列較為疏松。所以，苦參種子硬實(shí)不透水的主要原因可能是由角質(zhì)層和柵欄組織造成的，但硬實(shí)性具體形成的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。