陸國弟,楊扶德*,王惠珍,杜 弢,鄭 健,邢 豪
(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅 蘭州 730000;2.蘭州理工大學(xué),甘肅 蘭州 730050)
黃芪為豆科屬植物,具有很高藥用及食用價值。目前,全國大部分地區(qū)使用的是蒙古黃芪[Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge. var.mongholicus(Bge.)Hsiaode]的干燥根[1-2],藥用資源主要依靠栽培,但由于大量使用化肥農(nóng)藥,引起土壤酸化、土壤板結(jié)、土壤污染等問題,導(dǎo)致黃芪出苗率下降,根分支、木化嚴(yán)重[3-5],影響其產(chǎn)量和質(zhì)量,進而制約黃芪產(chǎn)業(yè)化發(fā)展及臨床療效。
沼液是有機物質(zhì)厭氧發(fā)酵的副產(chǎn)物,富含豐富氮、磷、鉀及多種微量元素[6],相比化肥更易被作物吸收利用,且保肥時間長,緩速供肥能力強,施用可以顯著提高作物產(chǎn)量,并對作物病蟲害有較好的防治作用,還可改善土壤理化性質(zhì),緩解土壤酸化板結(jié)等問題[7-8],作為浸種液,沼液中的營養(yǎng)成分被種子不同程度吸收后,能有效刺激種子內(nèi)酶的活性,從而促進胚細(xì)胞分裂,達到催芽和刺激生長的作用[9]。近年來,廣泛應(yīng)用于水稻、小麥等農(nóng)作物和青菜等蔬菜生產(chǎn)中[10-13],但在中藥材方面的應(yīng)用鮮有報道[14-16],尤其是應(yīng)用于黃芪浸種方面尚未報道,基于以上原因,本試驗以蒙古黃芪種子作為研究對象,通過2因素完全隨機設(shè)計試驗,結(jié)合主成分分析,探討不同沼液濃度和浸種時間對蒙古黃芪種子萌發(fā)及幼苗生理特性的影響,以尋求最佳沼液浸種濃度和時間組合,為黃芪產(chǎn)量和質(zhì)量的提高提供理論依據(jù)。
沼液(取自甘肅省皋蘭縣陽洼窯村以牛糞和玉米秸稈為主要原料的戶用沼氣池,其中含全氮:1.036 g·L-1,全磷:0.533 g·L-1,全鉀:1.186 g·L-1,有機質(zhì):10.75 g·L-1),蒙古黃芪種子(取自2017年甘肅省臨夏回族自治州和政藥用植物園,由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)杜弢教授鑒定)。硫酸、丙酮等試劑,均購于天津市大茂化學(xué)試劑廠,為分析純。
采用2因素完全隨機設(shè)計,沼液濃度:設(shè)0%(清水對照)、10%、25%、50%、75% 5個水平,浸種時間:設(shè)4、5、6 h 3個水平,每個處理重復(fù)10次。選擇成熟、飽滿、均勻一致的健康種子,分別用清水、10%、25%、50%、75%沼液,以淹沒種子5 cm為準(zhǔn),分別浸泡4、5、6 h,清水沖洗,0.05%次氯酸鈉溶液表面消毒5 min,蒸餾水清洗4~5次,通風(fēng)晾干,均勻擺放于已洗凈消毒的河沙培養(yǎng)皿規(guī)格中,每皿規(guī)格80粒,于光照培養(yǎng)箱[光照強度2 000 LX,光照時間12/12 h(光照12 h,黑暗12 h),恒溫20℃]中,培養(yǎng)7 d,第8 d測量各指標(biāo)。
培養(yǎng)次日開始逐日記錄發(fā)芽種子數(shù),連續(xù)7 d,計算種子萌發(fā)指標(biāo),公式如下:發(fā)芽勢(GE)=第4 d種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%
式中:Gt為第t d的種子發(fā)芽數(shù),Dt為Gt相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù);GI為發(fā)芽指數(shù),S為平均胚根長。
培養(yǎng)第7 d后,從每皿隨機選取10株幼苗,重復(fù)3次,毛刷刷凈其表面沙子,用刻度尺測定其胚根長、胚芽長;用萬分之一電子天平稱其胚根鮮重。
采用丙酮-乙醇研磨法測定[17],培養(yǎng)第10 d后,取黃芪樣品0.1 g左右進行Chla、Chlb、Chla+Chlb含量測定,每個處理重復(fù)3次。
取黃芪樣品0.1 g左右采用過氧化氫法[18]、氮藍四唑光化還原法[18]、愈創(chuàng)木酚法[18]分別測定過氧化氫酶(CAT)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性,每個處理重復(fù)3次。
采用硫代巴比妥酸法[18],取0.5 g黃芪樣品進行丙二醛(MDA)含量測定,每個處理重復(fù)3次。
采用TTC法[19],選取根長度、粗度基本一致的幼苗,用剪刀剪下根100條,進行根系活力測定。每個處理重復(fù)3次。
利用Excel 2007進行數(shù)據(jù)整理,origin 9.1軟件制圖,應(yīng)用 SPSS Statistics 22統(tǒng)計分析軟件對各指標(biāo)進行Duncan 新復(fù)極差法顯著性檢驗(P<0.05)及主成分分析。
由表1可知,蒙古黃芪種子萌發(fā)率很高,且萌發(fā)速率很快,培養(yǎng)第4 d種子萌發(fā)率達最高,經(jīng)清水浸種的發(fā)芽勢可達96.67%。不同沼液濃度處理,對各處理間種子發(fā)芽勢無顯著影響,但對種子發(fā)芽速度和長勢有顯著影響(P<0.05),其中以25%沼液處理的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)值最高,顯著高于其他4個沼液濃度處理(P<0.05),且10%、50%、75%沼液處理均顯著高于清水對照(P<0.05)。浸種時間對種子發(fā)芽勢無顯著影響,但對其發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)有顯著影響,浸種5 h種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著高于4 、6 h處理(P<0.05)。浸種濃度和時間互作,對各處理間種子發(fā)芽勢無顯著影響(表1),對其發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)具顯著影響,其發(fā)芽指數(shù)均以清水、10%、25%沼液浸種5 h較好,顯著高于其他浸種時間處理(P<0.05);50%、75%沼液浸種4 h均顯著高于其他浸種時間處理(P<0.05)?;盍χ笖?shù)以清水浸種6 h較好,顯著高于其他浸種時間處理(P<0.05);10%、25%、75%沼液浸種5 h值較高(P<0.05);50%沼液浸種以浸種4 h活力指數(shù)較好(P<0.05)。表明沼液浸種有助于黃芪種子發(fā)芽速度和生活力的提高,其中以25%沼液浸種5 h的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)值較高,均顯著高于其他14個處理(P<0.05)。
表1 不同處理間黃芪種子萌發(fā)及幼苗生物量多重比較結(jié)果(n=3)
表1顯示,不同沼液濃度處理,對黃芪幼苗根長、苗高、根重具顯著性影響,其根長和根重均顯著高于清水對照(P<0.05),且25%沼液浸種的根長和根重均顯著高于其他4個沼液濃度處理(P<0.05);50%沼液浸種的苗高顯著高于其他4個沼液濃度處理(P<0.05)。浸種時間對黃芪幼苗根長、苗高、根重具顯著性影響,浸種5 h的根長、根重均顯著高于4、6 h處理(P<0.05);浸種4、6 h的苗高均顯著高于5 h處理(P<0.05)。方差分析表明,沼液濃度和浸種時間互作顯著。其中,10%、25%、50%沼液浸種不同時間及75%沼液浸種4、5 h的根長均顯著高于清水對照處理(P<0.05);10%、25%沼 液 浸 種 不 同 時 間及50%沼液浸種4、5 h的根重均顯著高于清水對照處理(P<0.05);但75%沼液浸種6 h的根長、根重均顯著低于清水對照處理(P<0.05)。其中,以25%沼液浸種5 h的根長和根重值最高,均顯著高于其他14個處理(P<0.05)。對苗高而言,清水、50%、75%浸種均以6 h較好;10%、25%浸種均以4 h較好;其中,以25%沼液浸種4、6 h幼苗長勢最好,顯著高于其他14個處理(P<0.05)。綜上可知,使用適量的沼液對黃芪種子進行一定時間的浸種處理,有助于植株生物量的增加。
葉綠素是植物進行光合作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ),其中Chla和Chlb占葉綠素總色素的75%。由表2可知,Chla、Chlb、Chla+Chlb含量隨沼液濃度的增加均呈先增后降的趨勢,且顯著高于清水對照(P<0.05)。其中,25%沼液浸種的Chla、Chlb、Chla+Chlb含量均顯著高于其他4個沼液濃度處理(P<0.05)。浸種時間對葉綠素含量具顯著性影響,其中,浸種5 h的Chla、Chlb、Chla+Chlb含量均顯著高于4、6 h處理(P<0.05)。沼液濃度和時間互作顯著(表2),10%~75%沼液處理不同時間(除75%沼液浸種6 h)的Chla、Chlb、Chla+Chlb含量均顯著高于清水對照處理(P<0.05)。其中,以25%沼液浸種5 h的Chla、Chlb、Chla+Chlb含量較高,均顯著高于其他14個處理(P<0.05)。同時從表2可知,Chla、Chlb、Chla+Chlb含量隨著沼液濃度的增加,浸種時間的延長均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,由此可見,適宜沼液濃度浸種一定時間可顯著提高黃芪葉片Chla、Chlb、Chla+Chlb的含量。
表2 不同處理間黃芪幼苗生理生化指標(biāo)多重比較結(jié)果(n=3)
MDA是膜質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物,含量的多少可直接反映細(xì)胞膜損傷的程度。MDA含量越低,控制膜質(zhì)過氧化水平的能力越強,進而植株生理活性和抗逆性越強[18]。由表2可知,不同沼液濃度處理對黃芪幼苗MDA含量具顯著影響。其中,以25%沼液浸種的MDA含量顯著低于清水、其他沼液濃度處理(P<0.05),浸種時間對MDA含量具顯著影響,以浸種5 h MDA含量顯著低于4、6 h處理(P<0.05)。方差分析顯示,浸種濃度和時間互作顯著(表2),清水、10%、25%沼液均以浸種5 h MDA含量較低,均顯著低于其他浸種時間處理(P<0.05);50%、75%沼液均以浸種4 h的MDA含量較低,顯著低于5、6 h浸種時間(P<0.05)。其中,以25%沼液浸種5 h MDA含量最低,顯著低于其余14個處理(P<0.05)。
根系生長發(fā)育直接影響植株的生命活動,而根系活力的強弱直接反映根的吸收與合成能力。不同沼液濃度處理對根系活力具顯著影響(表2)。25%沼液浸種的根系活力值較高,顯著高于其他4個沼液濃度處理(P<0.05),且10%、50%、75%沼液處理的根系活力均顯著高于清水對照(P<0.05)。浸種時間對根系活力具顯著影響,以浸種5 h的根系活力顯著高于4、6 h處理(P<0.05)。浸種濃度和時間互作,可顯著影響黃芪幼苗根系活力。清水、10%、25%沼液均以浸種5 h其根系活力較強,顯著高于其他浸種時間處理(P<0.05);50%、75%沼液均以浸種4 h的根系活力較強,顯著高于5、6 h浸種時間(P<0.05)。但以25%沼液浸種5 h根系活力最強,顯著高于其余14個處理(P<0.05)。
方差分析顯示(圖1、2、3),不同沼液濃度處理,對黃芪幼苗3種抗氧化酶活性具顯著影 響(P<0.05),POD活 性、SOD活 性 均 以25%沼液處理最高,顯著高于清水、其他沼液濃度處 理(P<0.05);CAT活 性 以10%沼 液 處 理 最高,顯著高于其他4個沼液濃度處理(P<0.05);浸種時間對黃芪幼苗3種抗氧化酶活性具顯著影響,POD、SOD活性均以浸種5 h顯著高于4、6 h處 理;CAT活 性 以 浸 種6 h顯 著 高 于4、5 h處理。由圖1、2、3可知,浸種濃度和時間互作顯著,但3種抗氧化酶活性變化趨勢不同。在0%~25%沼液濃度范圍內(nèi),POD活性隨浸種時間的延長,呈先增后降的趨勢,且均顯著高于清水對照處理(P<0.05);但50%、75%沼液處理,隨浸種時間的延長均呈降低趨勢,各處理間具顯著性差異(P<0.05)。SOD活性變化趨勢(除10%沼液浸種5 h外)與POD活性一致。CAT活性在0%~10%沼液濃度范圍內(nèi),隨浸種時間延長呈先增后降的趨勢,并顯著高于清水對照處理(P<0.05);25%沼液處理,隨浸種時間的延長,呈現(xiàn)先增后降又增的趨勢,并顯著低于清水對照處理(P<0.05),而50%、75%沼液處理不同時間,呈先增后降的趨勢,各處理間均具顯著性差異(P<0.05)。其中,以25%沼液浸種5 h 的POD、SOD活性最強,75%沼液浸種4 h CAT活性最強,均顯著高于其余14個處理(P<0.05)。表明,適宜的沼液濃度和浸種時間處理,可有效增加黃芪幼苗體內(nèi)抗氧化酶活性,從而提高植株的抗逆性。
圖1 不同沼液濃度浸種不同時間的過氧化氫酶(CAT)活性
圖2 不同沼液濃度浸種不同時間的過氧化物酶(POD)活性
圖3 不同沼液濃度浸種不同時間的超氧化物歧化酶(SOD)活性
根據(jù)上述黃芪種子各指標(biāo)分析,均以25%沼液浸種5 h更有利于黃芪種子萌發(fā)及幼苗生長。本研究為了更客觀、準(zhǔn)確評價浸種濃度和時間最優(yōu)組合,以黃芪種子發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、根長、根重,Chla、Chlb、Chla+Chlb含量,POD、CAT、SOD活性,MDA含量及根系活力12個指標(biāo)為原始變量進行主成分分析。主成分的特征值和貢獻率作為選擇主成分的重要依據(jù),由表3可知,前3個主成分的累計貢獻率為91.991 0%,由此可見,這3個主成分可以反映黃芪種子萌發(fā)及幼苗生長性狀91%以上的信息。故通過計算這3個主成分的單項得分和綜合得分,便可評價沼液浸種濃度和時間最優(yōu)組合(表4)。由表4可知,第1主成分最高得分為25%沼液浸種5 h;第2主成分最高得分為25%沼液浸種6 h;第3主成分最高得分為25%沼液浸種5 h??苫九袛啵?5%沼液浸種5 h的黃芪種子萌發(fā)及幼苗生長的綜合表現(xiàn)最好。在計算各主成分得分的基礎(chǔ)上,計算出綜合得分,其綜合得分結(jié)果在15個處理中,以25%沼液浸種5 h得分最高,為128.322 9。這與各指標(biāo)單獨分析結(jié)果基本一致,說明采用主成分分析來評價沼液浸種濃度和時間的最優(yōu)組合是可行的。
表3 方差貢獻率和累計方差貢獻率
黃芪種子發(fā)芽率低,出苗不整齊,制約了黃芪產(chǎn)業(yè)化持續(xù)發(fā)展[20],分析原因除種皮存在較高硬實休眠特性外,種子帶菌嚴(yán)重[21],種皮內(nèi)存在很厚果膠物質(zhì)[22],不良條件下會失去吸脹能力,造成不可逆性。研究顯示沼液含多種可溶性小分子物質(zhì),可被種子直接吸收,進而提供種子發(fā)芽及幼苗生長足夠的營養(yǎng)元素,其次沼液中含抗菌類物質(zhì)[23-24],這些物質(zhì)能殺滅種子表面病菌,增強種子抗病力,起到催芽、壯苗的作用。正如本研究觀察到一樣,沼液浸種后,黃芪種子與清水相比,第一,無發(fā)霉現(xiàn)象,第二,可顯著提高黃芪種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。但試驗曾用全沼液處理后,隨浸種時間延長,首先延緩了種子萌發(fā),其次種子萌發(fā)后開始大量死亡,這可能是由于浸種濃度高、時間長,抑制種子呼吸,造成種子毒害作用。沼液浸種對黃芪種子發(fā)芽率影響不顯著,分析原因有2點:第一,試驗所用蒙古黃芪種子為當(dāng)年新采集種子,發(fā)芽率本身高;第二,接種在培養(yǎng)皿中的種子都是挑選吸水膨脹的,已達到了種子萌發(fā)所需水分,故沼液處理初期,濃度和時間對種子萌發(fā)影響不大。
分得合綜3 118.35-2 645.21-140.901-4 169.83 7 464.08 6 816.22-7 312.56 9 223.821 4 128.66-6 982.26 9 136.2-2 273.85-7 800.35 5 068.8-6 755.39-21分成主77 050.0-98 604.0 37 752.0-20 194.0 97 492.0 79 960.0 91 800.0-25 611.0-98 285.0-10 624.0-74 123.1 44 834.1 50 012.2-96 152.1 11 226.1-11分成主80 701.0 23 223.0 70 582.0-3 457.0 67 250.0 54 048.0 5 822.0-87 314.0-91 922.0 50 662.2 42 296.1-50 437.0-54 568.1-50 712.0 98 924.0 01分成主47 326.0-33 776.0-54 585.1 15 078.0-8 361.1 30 167.0-55 617.1 95 558.0-84 013.0-82 075.0 63 021.1 82 682.1-4 288.0-6 022.0-55 133.0 9分成主26 532.0-58 181.2 13 081.0 4 838.1-67 485.1 78 329.0-69 121.1-89 895.0 71 101.0 93 061.0-17 596.0-9 470.0-66 502.0-2 834.0 42 171.0 8分成主19 098.0-2 810.0-7 453.1 93 666.0 91 718.0 16 915.0 95 193.0-98 786.0 30 295.0-97 540.0-32 705.0-80 574.1 20 314.0-24 725.2-66 431.0-分得合綜7分成主37 234.1-85 870.1 69 076.1-40 434.0 86 302.0-35 441.0 10 323.0-58 562.0-92 345.0 98 101.0 72 178.1 14 913.0-1 554.0-30 140.1-81 835.1及分得分成6分成主8 289.0-58 344.0-4 122.1 53 328.0 60 342.0-67 434.0 3 057.1-23 689.0 54 555.1-50 941.0-51 645.0 90 811.1-49 801.0 89 513.1 27 508.0主各5813297455919 4表分成主0 912.0-0 660.0-1 345.0 3 577.0 9 432.0 1 043.0 9 031.0-6 601.1 0 593.2 9 273.1-7 890.0-3 465.1-2 677.0-9 012.0-8 559.0-4分成主89 530.0-9 682.0 45 771.0 27 095.0 92 880.1 16 794.0 42 893.1-29 109.1-38 982.0 71 288.0 39 837.0 79 375.0-54 443.1 13 182.0-40 507.1-3分成主66 214.0 44 774.0 85 602.0 77 587.1-10 183.1-35 805.1 57 240.0 23 952.1 79 133.0-85 101.1 85 710.1 82 406.0-78 030.0-10 247.0-35 051.1-2分成主19 168.1-56 658.1-61 485.0-33 020.1-74 495.0 96 501.0 1 173.0-26 807.0 65 232.1 84 190.1 1 050.0-3 160.1 85 053.0 96 728.0 41 822.0-1分成主91 973.0-15 341.0 9 065.1-25 900.1 3 891.1 16 026.0-19 661.1 88 806.1 19 382.1-5 715.0 17 432.0-63 849.0-11 386.0 13 881.0-57 111.1-h 4 h 5 h 6 h 4種h5種h 6種h 4種h 5種h 6種h 4種h 5種h 6種h 4種h 5種h 6種理種種種浸浸浸浸浸浸浸浸浸浸浸浸處浸浸浸液液液液液液液液液液液液水水水沼沼沼沼沼沼沼沼沼沼沼沼清清清%01%01%01%52%52%52%05%05%05%57%57%57
本研究發(fā)現(xiàn),用25%沼液浸種5 h,黃芪幼苗與其他處理相比,存在以下區(qū)別:第一,葉片顏色較深,且較大而厚;第二,根較粗而長。經(jīng)葉綠素含量、根長、根重、根系活力測定,其值也是顯著高于其他14個處理。這是因為沼液中含有豐富的全氮、全鉀(前期所測沼液中含氮、鉀量均高出含磷量2倍),這兩種營養(yǎng)成分對作物葉綠素、光合速率、呼吸作用等都有明顯的影響[25],而25%沼液浸種5 h相比其他14個處理,黃芪幼苗所含氮和鉀濃度可能更有利于其葉綠素、碳水化合物的合成,促使光合產(chǎn)物積累增加,物質(zhì)供應(yīng)充足,從而加快根營養(yǎng)成分積累,進而使黃芪生物量顯著增加,同時沼液中存在氨基酸、維生素等活性物質(zhì)可提高根系活力,促進植物根系發(fā)育[26]。而根系活力代表植株吸收、合成、呼吸等整個代謝的強弱,能反映根系的生命活動,并與整個植株生命活動強度緊密相關(guān)[27]。袁大剛等研究表明,使用不同沼液濃度和浸種時間可顯著影響萬壽菊根系活力[15],并隨沼液濃度增加和浸種時間的延長,萬壽菊根系活力呈先增后降的趨勢,與本研究結(jié)果類似。
植物在逆境(干旱、毒害)條件下,體內(nèi)會積累大量的活性氧物質(zhì),這些活性氧會破壞膜系統(tǒng)。短時間脅迫,可刺激植物啟動自身活性氧清除系統(tǒng)(SOD、POD和CAT活性氧清除酶類),幫助植物度過難關(guān),提高抗逆性,但超出植物消除能力,就會對植物造成傷害。而MDA是膜質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,其積累的多少可判斷植物受損程度及抗逆性強弱[28]。本研究表明,低濃度沼液(10%~50%)浸種4、5 h,黃芪幼苗MDA含量積累顯著降低,POD、SOD、CAT活性顯著增強,這是因為沼液中存在的多種活性物質(zhì),給植株提供足夠營養(yǎng)的同時,增強了其活力,進而加強了植株自生防御系統(tǒng),減少了幼苗細(xì)胞膜的損傷程度,這與薛延豐等用生理生化參數(shù)評價水葫蘆沼液浸種對青菜生長情況的研究結(jié)果相似[29],而高濃度沼液(75%)浸種4~6 h,MDA含量顯著升高,3種抗氧化酶活性顯著降低,分析原因有2點:第一,不同植物抗性有所差異;第二,沼液成分復(fù)雜,可能存在其他尚不清楚的生物抑制物質(zhì),使用高濃度沼液后,浸種時間過長,這些生長抑制物質(zhì)在植株體內(nèi)蓄積較多,就會對植株造成不可逆的損傷。
沼液浸種可有效提高蒙古黃芪種子生活力及萌發(fā)速度,其含有的活性物質(zhì)可增強黃芪幼苗葉片光和能力,促進根系生理活性物質(zhì)積累,增強植株抗逆能力,從而提高其產(chǎn)量和質(zhì)量。但浸種時一定要掌握好沼液浸種濃度和時間。本研究得出,以25%沼液浸種5 h時黃芪種子萌發(fā)及幼苗生長效果最佳,值得關(guān)注的是,需要更準(zhǔn)確得出提高黃芪產(chǎn)量和質(zhì)量的沼液濃度,還需進一步盆栽、大田試驗,也是本項目下步主要工作。該研究為提高黃芪產(chǎn)量,改善黃芪質(zhì)量,以及沼液浸種在中藥材方面的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。