馬 莉，封 宇，艾莉偉△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

血管性癡呆(Vascular Dementia，VD)是與腦血管損傷相關的血管性認知障礙綜合征中的癡呆亞型。血管性癡呆約占癡呆總患病率的30%，是老年人發(fā)生癡呆最常見的原因之一[1]，其發(fā)病機理與治療手段目前尚無明確指南[2]。VD的最常見病因是缺血性卒中，而神經(jīng)元的凋亡是腦缺血引發(fā)腦組織損害的重要原因之一。研究表明，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)信號通路是介導細胞反應的重要信號系統(tǒng)，能夠對多種細胞生長因子和促有絲分裂物質做出反應，把細胞外信號從細胞表面?zhèn)鲗У郊毎|內(nèi)部，在細胞增殖、分化和凋亡過程中發(fā)揮重要作用[3]。MAPK家族中細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)的突觸可塑性在形態(tài)和功能上的修飾，可以影響到神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育、損傷修復以及學習記憶等多種腦功能[4]。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)通路的激活則主要介導炎癥及應急反應中的細胞凋亡[5]。通過臨床觀察可發(fā)現(xiàn)，電針治療可改善血管性癡呆患者的認知與學習記憶能力[6]。本研究以血管性癡呆大鼠為模型，觀察了電針調節(jié)對MAPK通路中ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38及Bcl-2、Bax指標的影響，現(xiàn)報道如下。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 純系Wistar健康雄性大鼠60只，18～20月齡，體質量為(500±20)g，均由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.1.2 主要儀器與試劑 一次性無菌針灸針，直徑0.25 mm×25 mm(貴州安迪藥械有限公司)；腦復康吡拉西坦片0.4 g(杭州民生藥業(yè)集團有限公司)；KWD-808Ⅰ脈沖電針儀(常州市武進長城醫(yī)療器械有限公司)；大鼠程控穿梭箱DCS-2型(中國醫(yī)學科學院藥物研究所)；兔抗Phospho-p44/p42 MAPK(Erk1/2)Antibody、兔抗p44/p42 MAPK(Erk1/2)Antibody、兔抗p38 MAPK Antibody、兔抗Phospho-p38 MAPK Antibody、兔抗GAPDH(美國CST公司)；兔抗Bcl-2、Bax 、HRP-羊抗兔IgG二抗、BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學發(fā)光試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 造模方法

60只大鼠適應性喂養(yǎng)3周后，隨機分組法分為模型組、假手術組、電針組、西藥組4組，每組各15只。采用分次結扎頸總動脈法造模，即改進的2-VO法[7]：術前12 h禁食水，小容器乙醚棉球罩頭麻醉，保證術間自主呼吸，消毒，一側頸總動脈上方處切開，鈍性分離該側頸總動脈及神經(jīng)，以4號絲線雙重結扎，縫合切口。7天后行另一側結扎，與上法相同。放回籠中保溫飼養(yǎng)，術后大鼠肌內(nèi)注射青霉素20萬單位，連續(xù)5天，以防感染。假手術組僅分離雙側頸總動脈后縫合。

1.3 治療方法

待術后7天，傷口完全愈合后進行治療。電針組按照于致順老師頭穴針法，分別于VD大鼠頭部從額區(qū)神庭至囟會(參照《實驗動物針灸穴位圖譜》及《實驗針灸學》)及其左右各1寸、2寸的平行線處叢刺，各5針，將左右最外側兩針連接電針儀，波形選用疏密波，頻率2 Hz，大鼠耳部輕微顫抖為度，持續(xù)20 min，電針結束后留針30 min，每日1次。西藥組術后7天，給予濃度為40 mg/mL的腦復康水溶液灌胃，每日1次。余兩組分別給予等量生理鹽水灌胃，每日1次。4組均于3天后停止治療。

1.4 行為學測試

各組大鼠治療前及治療后均進行穿梭箱實驗，測評4組大鼠的行為學變化。將大鼠先移入實驗環(huán)境中適應性訓練3 min，測試時間為5 min。實驗開始后，當電源開啟發(fā)出蜂鳴聲后，穿梭箱底部左側通電，遭受電刺激的大鼠被動逃避至穿梭箱右側；再次警鳴后，穿梭箱底部右側通電，大鼠被電刺激被動逃避至左側。重復上述步驟，大鼠聽到警鳴后主動逃避，即從一側逃至另一側。實驗記錄儀分別記錄下大鼠遭受電擊次數(shù)與電擊時間等。

1.5 蛋白質免疫印跡(WB)試驗

穿梭箱實驗后，各組大鼠在規(guī)定時間內(nèi)以10%水合氯醛(40 mg/kg)腹腔麻醉，開胸暴露心臟后用0.9%生理鹽水和4%PBS緩沖液快速沖洗灌注。參照孫曉彩等的方法[5]分離取出雙側海馬CA1區(qū)組織，碾碎裂解提取總蛋白，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒進行定量，凝膠電泳，轉移至硝酸纖維素膜。將膜置于5%脫脂奶粉封閉，室溫下孵育1 h，與一抗兔抗ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、Bcl-2、Bax(1∶1 000)及內(nèi)參GAPDH(1:1 000)4℃孵育過夜，后滴加羊抗兔二抗孵育60 min，TEST洗膜，ECL顯色曝光，將所得底片掃描存檔，并用Image-Pro Plus進行蛋白灰度分析。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)分析，多組間樣本均數(shù)的比較用One-Way ANOVA檢驗，各組間兩兩比較采用t檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組行為學檢測比較

表1結果顯示：治療前，與模型組相比假手術組電擊次數(shù)與電擊時間顯著降低(P<0.05)，說明造模成功。治療后，與模型組相比電針組、西藥組均能夠降低電擊次數(shù)與電擊時間(P<0.05)，提示兩種治療手段對VD大鼠病情均有改善；西藥組與電針組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠行為學結果比較

注：與模型組對比，*P<0.05；與電針組對比，▼P>0.05。

2.2 各組凋亡通路蛋白Bcl-2、Bax表達比較

圖1、表2結果顯示：假手術組中與模型組比較大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2與Bax均有一定量蛋白表達。假手術組與模型組相對比,Bcl-2蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，假手術組中Bax蛋白表達顯著下調(P<0.05)。電針組、西藥組與模型組相對比,電針組與西藥組中的Bcl-2蛋白表達顯著上調(P<0.05)，Bax蛋白表達顯著下調(P<0.05)；電針組與西藥組兩之間比較Bcl-2與Bax蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2和Bax的蛋白表達

2.3 各組MAPK/ERK通路蛋白ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38表達比較

圖2、表3結果顯示,VD模型組大鼠海馬CA1區(qū)ERK1/2與p38的蛋白總表達無明顯變化。假手術組與模型組比較p-ERK1/2蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，假手術組中p-p38蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。電針組、西藥組與模型組比較：電針組、西藥組的p-ERK1/2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，p-p38蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；西藥組與電針組比較，西藥組的p-ERK1/2、p-p38蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2和Bax蛋白表達比較

注：與模型組對比，*P<0.05,△P>0.05；與電針組對比，▼P>0.05。

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38的蛋白表達

組別ERK1/2/GAPDHp-ERK1/2/GAPDHp38/GAPDHp-p38/GAPDH假手術組1.15±0.130.37±0.26△0.75±0.210.11±0.04?模型組1.21±0.180.39±0.220.81±0.190.39±0.10電針組1.19±0.200.84±0.17?0.78±0.130.18±0.07?西藥組1.22±0.210.86±0.19?▼0.79±0.110.17±0.05?▼

注：與模型組對比，*P<0.05,△P>0.05；與電針組對比，▼P>0.05。

3 討論

血管性癡呆(VD)在中醫(yī)學屬于“癡呆”“呆病”“中風”范疇，病位在腦?！鹅`樞·海論》即有記載：“腦為髓之海，其輸上在于其蓋，下在風府?！庇帧啊韬２蛔?，則腦轉耳鳴，脛酸眩冒，目無所見，懈怠安臥?！蔽以河谥马樌蠋熗ㄟ^選取頭部體表及其周圍腧穴或功能區(qū)治療腦源性疾病[8]。近年來電針治療因其療效明顯，方法簡便，于臨床應用廣泛。評估嚙齒類動物學習記憶能力，常用可定量描述實驗大鼠主動回避反應等特征的行為學測量工具穿梭箱來進行[9]。本實驗中采取電針治療VD大鼠額區(qū)，通過穿梭箱實驗檢測，證實了電針對于大鼠認知學習能力的提升。

神經(jīng)細胞凋亡及炎癥反應被認為是造成血管性癡呆的認知障礙的重要因素，如何通過治療手段來調節(jié)細胞的動態(tài)凋亡過程，以增加細胞存活率是當前重要研究方向。研究發(fā)現(xiàn)針刺可通過調節(jié)一氧化氮(NO)含量及其他誘發(fā)細胞凋亡因素起到療效[10]。Zuowei L等發(fā)現(xiàn)早期進行針刺干預與Bcl-2和Bax基因表達有關，這兩個基因表達的變化與其陽性細胞數(shù)的變化一致，而表達率的變化與Bcl-2陽性細胞數(shù)量變化正相關，而Bax基因表達的變化則與之相反[11]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是一系列相關的絲氨酸/蘇氨酸激酶和信號轉導介質，調節(jié)各種細胞功能。MAPK由4個亞家族組成：細胞外信號調節(jié)激酶(ERK1/2，也稱為p44/p42)；jun-NH2-末端激酶1/2(JNK1/2，也稱為應激激活蛋白激酶或p54/p46)；p38 MAPK和ERK5[12]，這些信號通路參與介導腦缺血損傷中神經(jīng)細胞周期控制、細胞凋亡和細胞凋亡分化[13]。研究證明ERK1/2被激活磷酸化后在下游發(fā)揮作用，通過調節(jié)抗凋亡或促凋亡途徑Bcl-xL、Bax和AIF的表達，來抑制神經(jīng)細胞凋亡和梗塞體積[14]。楊忠華等的研究表明，p-ERK1/2的高表達可能只限于缺血缺氧的早期[15]。而p-p38長期活化參與神經(jīng)細胞凋亡[16]，p-p38抑制劑促進體外多種神經(jīng)元的存活[17]。p38的激活會阻礙ERK1/2的保護性通路，從而導致凋亡[18]。細胞凋亡是生物發(fā)育過程中的必經(jīng)之路，同時存在于生理和病理過程中?？梢姡珽RK1/2與p38MAPK之間通過動態(tài)平衡來調節(jié)細胞的凋亡[19]，若此動態(tài)平衡失衡則可能加速細胞凋亡。p-ERK 1/2和p-p38的動態(tài)調節(jié)在血管性癡呆疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。實驗結果顯示,治療后血管性癡呆模型組大鼠的行為學檢測中電擊次數(shù)和電擊時間明顯多于治療前模型組，表明治療有效；而經(jīng)過額區(qū)電針治療的電針組VD大鼠行為檢測結果明顯優(yōu)于模型組，免疫印跡試驗中因GAPDH在組織中表達恒定，故被廣泛用作細胞蛋白質標準化內(nèi)參，通過將目的蛋白含量與樣本GAPDH含量相除來矯正誤差。其結果顯示經(jīng)電針治療后Bax蛋白表達率比模型組明顯降低，Bcl-2蛋白表達率明顯升高，證明電針治療有對神經(jīng)細胞的凋亡有抑制作用。WB實驗中，ERK1/2、p38蛋白表達量在假手術組、模型組、電針組及西藥組4組的表達大致相同，而電針組與模型組相比p-ERK1/2升高而p-p-38 MAPK降低，證明了通過調控磷酸化的ERK1/2、p38的表達，電針和西藥均對VD大鼠的治療效果顯著。研究表明，針灸影響VD病理過程的多個方面，其通過保護大腦神經(jīng)元免受氧化應激、細胞凋亡和神經(jīng)炎癥，調節(jié)葡萄糖代謝和神經(jīng)遞質來改善認知功能。針灸還可以改善突觸可塑性和血管功能[20]。并由此推測，電針治療可調控MAPK通路使其磷酸化，通過升高p-ERK1/2蛋白表達水平和降低p-p38MAPK蛋白的表達水平，抑制大鼠海馬區(qū)CA1神經(jīng)細胞的凋亡，促進了神經(jīng)元功能的恢復。而電針組和西藥組的治療效果無明顯差別，但電針由于其無副作用、操作簡便，故綜合評比優(yōu)于西藥組。

綜上所述，額區(qū)電針治療對血管性癡呆具有腦保護作用，其機制可能上調表達p-ERK1/2蛋白，下調表達p-p38MAPK蛋白有關，動態(tài)調節(jié)了兩條信號通路，從而通過降低神經(jīng)元的壞死來發(fā)揮腦保護功能。而ERK、p38的動態(tài)平衡是維持及調節(jié)細胞存活的重要條件。該實驗結果為臨床應用電針治療血管性癡呆提供了理論依據(jù)，也為該病的研究與治療提供了新的思路。