肖 飛，劉 鵬，程光宇，畢海洋，于楠楠

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

癲癇(epilepsy)為神經(jīng)內(nèi)科疑難病，其患病率僅次于腦卒中疾病，是一種發(fā)作突然且短暫，反復(fù)發(fā)作的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常的腦部疾病[1-2]。迄今為止，隨著對癲癇的不斷深入研究，普遍認為其發(fā)病機制與細胞凋亡及線粒體損傷功能異常等密切相關(guān)[3]。Caspase-3即為介導(dǎo)細胞凋亡的核心蛋白酶，活化的Caspase-3更為各種凋亡通路的共同中介，并與線粒體關(guān)系密切。癲癇發(fā)作可引起線粒體Ca2+超載，使Cyt C由線粒體膜間隙釋放入胞漿并與Apal-1結(jié)合，Apal-1通過其Caspase結(jié)構(gòu)域激活Caspase-9進而激活其下游的Caspase-3，引起核染色質(zhì)凝聚，DNA斷裂，終使海馬神經(jīng)元凋亡[4-5]。Bcl-2則為抗凋亡的代表，其可調(diào)控線粒體通透性而起到抑制細胞凋亡的作用，亦可對Caspase-3的活化起到抑制作用[6]。本研究即通過天麻素穴位注射療法對戊四氮致癇大鼠行為學(xué)及腦內(nèi)海馬區(qū)凋亡調(diào)控因子Bcl-2、Caspase-3的表達影響進行觀察，進一步證實天麻素穴注法干預(yù)治療癲癇模型大鼠療效肯定，為臨床癲癇的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康雄性Wistar大鼠120只，SPF級，體質(zhì)量：250～325 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。實驗大鼠常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，在其尾部標記編號，并按隨機數(shù)字表法分為空白組(N組)、模型組(M組)、穴注組(AI組)及西藥組(SV組)，每組各30只。

1.2 實驗藥物、試劑及配置

天麻素(昆明制藥集團股份有限公司，批號：H20013046，0.2 g/支)，充分溶解于150 mL 0.9%氯化鈉溶液中(濃度：2 mg/mL)，按人與大鼠等效劑量比例換算，用量為0.37 mL/kg；丙戊酸鈉緩釋片(山東仁和堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：H19983059，0.2 g/片)，加入羧甲基纖維素鈉(國藥集團化學(xué)試劑公司生產(chǎn))中充分溶解，配成混懸灌胃液(濃度為20 mg/mL)，4℃遮光保存；戊四氮(PTZ,美國Sigma公司,貨號：Sigma-P6500)，于每次實驗前30 min，取PTZ晶體300 mg，充分溶解于150 mL 0.9%氯化鈉溶液配置成PTZ溶液(濃度為2 mg/mL)；10%水合氯醛(購自天津市大茂化學(xué)試劑廠)；SABC試劑盒、RT-PCR試劑盒、Western Blot試劑盒、Bcl-2及Caspase-3抗體(上海瑞齊生物科技有限公司)；2 mL無菌注射器(上海米沙瓦醫(yī)科工業(yè)有限公司，國械注準20153152150)。

1.3 模型制備

M、AI、SV組實驗大鼠于每日上午8：30—11：30間給予腹腔注射PTZ溶液35 mg/kg，N組每天給予等劑量0.9%氯化鈉注射液，連續(xù)注射28天以點燃慢性癲癇大鼠動物模型。于每次注射后，觀察1 h大鼠的行為變化，而后進行癇性發(fā)作評價，根據(jù)Racine分級標準[7]對大鼠的癇性發(fā)作情況進行評價，并記錄每只大鼠的癇性發(fā)作等級，對可能發(fā)生的意外情況進行干預(yù)，如出現(xiàn)3 min及以上的V級發(fā)作時，立即以10%水合氯醛腹腔注射以終止其癇性發(fā)作，防止死亡。造模周期內(nèi)，連續(xù)5天出現(xiàn)Ⅳ級及以上的癇性發(fā)作，視為造模成功，期間對于不符合模型或死亡者應(yīng)剔除并補充相應(yīng)數(shù)目大鼠保證樣本數(shù)量恒定。

1.4 干預(yù)方法

N組在造模期間給予等時間、等劑量0.9% 氯化鈉溶液腹腔注射，連續(xù)28天。模型組按上述造模方法給予處置。AI組在造模成功后，參照《實驗針灸學(xué)》[8]及華興邦制定的《實驗動物圖譜》[9]所述方法，選定實驗大鼠腧穴百會及大椎，并給予標記,給藥時按照0.37 mL/kg的給藥劑量將配置好的天麻素溶液均等的注射于上述穴位，注射時百會穴采取平刺0.1 cm進行注射，大椎穴采取直刺0.5 cm進行注射，隔日1次，連續(xù)28天。SV組于造模成功后，連續(xù)給予配置好的丙戊酸鈉溶液(350 mg/kg)灌胃28天，日1次。

1.5 標本取材與檢測

用10%水合氯醛(5 mL/kg)麻醉后，常規(guī)剪毛、消毒、開胸、灌注、斷頭，迅速分離海馬及腦組織，將1 mm3大小組織塊置于2.5%戊二醛固定液中前固定，4℃保存24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，并按試劑盒操作說明書以SABC法檢測Bcl-2、Caspase-3陽性細胞數(shù)，RT-PCR法檢測Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達，Western Blot法檢測Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

以SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，進行單因素方差分析及顯著性檢驗。若方差齊時采用LSD法檢驗，方差不齊時進行轉(zhuǎn)換后再重復(fù)以上分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)觀察結(jié)果

在PTZ造模開始后，模型組大鼠活動較前活躍，進食水明顯增多，持續(xù)約1 h后趨于平靜。模型點燃1周后逐漸出現(xiàn)面部及耳部抽搐、流涎、單側(cè)或雙側(cè)前肢抽搐、身體直立甚至互相撕咬，上述癥狀隨點燃次數(shù)的增加而逐漸加重，以Ⅰ～Ⅳ級多見；連續(xù)注射戊四氮4周后部分癲癇模型大鼠出現(xiàn)Ⅴ級癇性發(fā)作。而丙戊酸鈉組及穴位注射組模型大鼠在藥物干預(yù)28天后癇性發(fā)作次數(shù)明顯減少，且發(fā)作級別顯著下降，以Ⅰ～Ⅱ級為主。

2.2 各組實驗大鼠海馬區(qū)Bcl-2表達

實驗結(jié)果表明，與N組相比較，M、AI及SV組抗凋亡因子Bcl-2在陽性細胞數(shù)、基因及蛋白方面的表達均升高，差異顯著(P<0.05)；與M組相比，AI及SV組抗凋亡因子Bcl-2在陽性細胞數(shù)、基因及蛋白方面的表達升高更為顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而AI組與SV組相比較，抗凋亡因子Bcl-2在陽性細胞數(shù)、基因及蛋白方面的表達未見顯著差異(P>0.05)。見表1、圖1～2。

表1 各組實驗大鼠海馬區(qū)Bcl-2表達

注：與N組比較，△P<0.05；與M組比較，*P<0.05；與AI組比較，▲P>0.05。

圖1 各組Bcl-2陽性細胞數(shù)、基因及蛋白的表達

圖2 各組Bcl-2蛋白表達

2.3 各組實驗大鼠海馬區(qū)Caspase-3表達

實驗結(jié)果表明，與N組比較，M、AI及SV組凋亡因子Caspase-3在陽性細胞數(shù)、基因及蛋白方面的表達均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與M組相比，AI 及SV組凋亡因子Caspase-3在陽性細胞數(shù)、基因及蛋白方面的表達顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而AI組與SV組相比較，凋亡因子Caspase-3在陽性細胞數(shù)、基因及蛋白方面的表達未見顯著差異(P>0.05)。見表2、圖3～4。

3 討論

調(diào)查結(jié)果表明，癲癇作為一種發(fā)作性疾病，在青少年中活動性癲癇的發(fā)作率為8%，而中國西部癲癇持續(xù)狀態(tài)所引發(fā)的死亡率為15.9%，嚴重影響患者的生存質(zhì)量[10]。因此，對癲癇的治療已然得到當(dāng)今社會的強烈關(guān)注。在治療方面，西醫(yī)多采用口服藥物及手術(shù)的方式，且以口服藥物治療為主，并取得較好療效。但在控制癲癇發(fā)生的同時，口服藥物治療亦伴有肝腎損傷、認知障礙、內(nèi)分泌紊亂、電解質(zhì)紊亂及共濟失調(diào)等不良反應(yīng)，且長時間應(yīng)用口服藥物亦伴有依從性差的發(fā)生，而手術(shù)治療的成功率較低，故現(xiàn)急迫需要探究一種安全有效、無不良反應(yīng)的治療方式。

表2 各組實驗大鼠海馬區(qū)Caspase-3表達

注：與N組比，△P<0.05；與M組比較，*P<0.05；與AI組比較，▲P>0.05。

圖3 各組Caspase-3陽性細胞數(shù)、基因及蛋白的表達

圖4 各組Caspase-3蛋白表達

中醫(yī)學(xué)將癲癇稱之為“癇證”“巔疾”。《靈樞》言：“頭重癇……四肢之脈皆脹而縱”，首次記載了癲癇發(fā)病時肢體痙攣的相關(guān)癥狀，臨床多表現(xiàn)為昏不知人、瘛疚抽掣、甚或角弓反張、口吐涎沫等?！兜は姆ā酚涊d：“非無痰涎壅塞，迷悶孔竅”，指出“痰”為癇證發(fā)病的根本病因。同時《難經(jīng)》有言：“重陰者癲，重陽者狂”，且《醫(yī)述·癲狂癇》亦記載：“天地一陰陽也，陰陽和則天清地凝，一有偏性，遂有非常之變。”指出陰陽和則神清志寧，故在治“痰”的同時，調(diào)其陰陽，不使其有所偏勝，則郁逆得消，神氣復(fù)常。天麻素為中藥天麻塊莖提取物，據(jù)《本草匯言》記載：“天麻...癲癇強痙，四肢攣急”，具有熄風(fēng)止痙、祛風(fēng)通絡(luò)的作用。經(jīng)現(xiàn)代藥理研究表明，天麻具有較好的鎮(zhèn)靜安眠、鎮(zhèn)痛、增加椎基底動脈及小腦下動脈等部位血流量、抗驚厥以及抗癲癇的作用[11]。而天麻素作為天麻的有效成分之一，亦有研究指出其可對抗陣攣性驚厥，具有減輕神經(jīng)元的損傷并抑制其凋亡的作用，可降低癲癇模型大鼠發(fā)作等級[12-13]。

穴位注射又名“水針”，是由傳統(tǒng)中醫(yī)針灸療法發(fā)展而來，將現(xiàn)代提純藥物結(jié)合針刺手段輸注于相應(yīng)穴位、經(jīng)絡(luò)，進而取得更為顯著的療效。本實驗即選用天麻素輸注于患者百會穴及大椎穴，以此療法抑制癲癇模型大鼠癇性發(fā)作，效果顯著。百會穴首見于《針灸甲乙經(jīng)》，其位居巔頂之中，為五臟六腑奇經(jīng)三陽百脈會聚之所。而頭為諸陽之會，百脈之宗，故百會穴能通達陰陽脈絡(luò)，聯(lián)系周身經(jīng)絡(luò)，具有祛痰熄風(fēng)、醒神開竅，止痙的作用。大椎穴又名百勞穴，首見于《素問·氣府》篇，為三陽督脈之會，通諸陽。而督脈入腦絡(luò)心，故大椎穴能調(diào)節(jié)陰陽平衡，疏通周身經(jīng)絡(luò)，具有醒腦開竅、鎮(zhèn)痙熄風(fēng)的作用。同時百會穴與大椎穴均位于體表，取穴方便，操作簡單，故本實驗選用天麻素穴注此二穴，以期達到醒腦開竅、祛痰熄風(fēng)止痙的功效。

而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為,癲癇的發(fā)作與細胞凋亡及線粒體損傷功能異常有關(guān)。細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，癲癇發(fā)作尤其在癲癇持續(xù)狀態(tài)時，常有大量海馬神經(jīng)細胞受損進而引起其凋亡，而凋亡的發(fā)生又進一步加重了海馬神經(jīng)細胞的損傷，并導(dǎo)致與凋亡相關(guān)的因子表達亦發(fā)生變化[14-16]，其中Caspase-3作為促凋亡因子以及Bcl-2作為抗凋亡因子，均在癲癇的發(fā)作過程中發(fā)揮了重要的作用。Caspase家族所產(chǎn)生的級聯(lián)反應(yīng)被稱為細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，而Caspase-3為其下游最重要的終末剪切酶，在級聯(lián)切割途徑中處于核心位置[17-18]。研究表明，癲癇所致的海馬神經(jīng)細胞凋亡過程中， 活化的Caspase-3發(fā)揮著重要的作用[19-22]。Bcl-2作為Bcl-2蛋白家族中抗凋亡成員，起著維持細胞凋亡-抗凋亡平衡的作用[23]，同時Bcl-2具有抑制線粒體中內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶及細胞色素C釋放的作用，進而可干預(yù)Caspase-3活化并發(fā)揮抗凋亡的作用，并認為其可能對Caspase-3的合成亦起到一定抑制作用[24-25]。故本實驗通過天麻素穴注的方式干預(yù)Caspase-3、Bcl-2的表達以明確其調(diào)控癲癇發(fā)作的作用機制，以期為癲癇的治療提供新的方向。

實驗結(jié)果表明，應(yīng)用天麻素穴注百會及大椎穴干預(yù)戊四氮致癇模型大鼠，可有效減少模型大鼠癇性發(fā)作的次數(shù)，并降低癇性發(fā)作的等級。同時天麻素穴注百會及大椎穴亦可有效提高模型大鼠Bcl-2陽性細胞數(shù)、基因及蛋白的表達，并降低Caspase-3陽性細胞數(shù)、基因及蛋白的表達，與模型組比較差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明天麻素穴注對癲癇模型大鼠癇性發(fā)作具有較好的抑制作用。而天麻素穴注組與丙戊酸鈉組模型大鼠海馬區(qū)Bcl-2、Caspase-3的陽性細胞數(shù)、基因及蛋白表達相比較無明顯差異(P>0.05)，說明天麻素穴注與丙戊酸鈉灌胃治療對癲癇模型大鼠的治療效果相當(dāng)。綜上所述，天麻素穴注可有效抑制癇性發(fā)作，并調(diào)控抗凋亡因子Bcl-2及凋亡因子Caspase-3的表達，進而發(fā)揮對海馬神經(jīng)元的保護作用。因此，天麻素穴注治療癲癇值得臨床進一步研究與推廣。