鄭可心，張秀梅

0 引言

近年來(lái)，隨著人們生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的改變，大腸癌在我國(guó)乃至世界的發(fā)生率顯著增加，是發(fā)病率與死亡率最高的癌癥之一[1]。已有研究證實(shí)：腫瘤細(xì)胞為滿(mǎn)足其快速增殖的需要，消耗大量的葡萄糖，即使在氧氣充足的條件下也主要依靠糖酵解供能，這種代謝特征被稱(chēng)為Warburg效應(yīng)或有氧糖酵解[2-4]。己糖激酶（hexokinase,HK）是糖酵解的第一個(gè)關(guān)鍵酶。目前已知哺乳動(dòng)物體內(nèi)有四種同工酶（HKⅠ、HKⅡ、HKⅢ和HKⅣ）。有研究表明[5-6]，腫瘤細(xì)胞中HKⅡ的活性與正常細(xì)胞相比明顯升高，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞在缺少氧氣的情況下仍能有足夠的能量供應(yīng)。磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway,PPP）又稱(chēng)磷酸戊糖旁路。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD）是PPP的關(guān)鍵酶。該途徑的代謝產(chǎn)物為NADPH和5-磷酸核糖（ribose-5-phosphate,R-5-P）。對(duì)于快速增殖的細(xì)胞尤其是腫瘤細(xì)胞，充足的NADPH及R5P的供應(yīng)是維持其生長(zhǎng)繁殖所必需的。已有文獻(xiàn)證實(shí)[7-8]：腫瘤細(xì)胞中PPP流量較正常細(xì)胞明顯提高，其主要機(jī)制是腫瘤細(xì)胞內(nèi)G6PD異常激活及表達(dá)增加。

因此，G6PD和HKⅡ可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究旨在探討G6PD對(duì)大腸癌HCT116和SW480細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、侵襲的影響及G6PD與HKⅡ在大腸癌組織中的表達(dá)情況及兩者的相關(guān)性，為探討大腸癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制及臨床診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑

本實(shí)驗(yàn)室保存的HCT116、SW480細(xì)胞。大腸癌組織芯片包括89對(duì)癌組織和癌旁組織購(gòu)自上海芯超公司。兔抗人的G6PD和HKⅡ多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的IgG、免疫組織化學(xué)二抗試劑盒、DAB染色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，小干擾RNA購(gòu)自上海吉瑪公司，葡萄糖氧化酶試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染

將HCT116和SW480細(xì)胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞接種于6孔板或12孔板中，待細(xì)胞密度至60%～70%時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染，進(jìn)行過(guò)表達(dá)和干擾G6PD實(shí)驗(yàn)。過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)分為Flag空載體轉(zhuǎn)染組和Flag-G6PD轉(zhuǎn)染組，干擾實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組和G6PD-Homo-318、G6PD-Homo-873、G6PDHomo-1504轉(zhuǎn)染組。6 h后更換為含有10%胎牛血清和雙抗的RPMI 1640完全培養(yǎng)液。

1.3 Western blot法檢測(cè)HCT116、SW480細(xì)胞中G6PD和HKⅡ的表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染過(guò)程同上。G6PD過(guò)表達(dá)組于換液后48 h時(shí)收集細(xì)胞，siRNA干擾組于換液后36 h時(shí)收集細(xì)胞。將收集的細(xì)胞加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑提取總蛋白。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，各組調(diào)成相同濃度后變性完成樣品制備。將蛋白經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳分離，90 V 90 min轉(zhuǎn)至PVDF膜，用含5%的脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，膜與G6PD、HKⅡ和actin抗體結(jié)合，4℃孵育過(guò)夜。經(jīng)TBST洗滌后，用二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌后ECL發(fā)光法成像。

1.4 培養(yǎng)液中葡萄糖濃度的測(cè)定

G6PD過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染42 h，siRNA干擾實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染30 h后更換完全培養(yǎng)液，換液后6 h收集培養(yǎng)液，按照葡萄糖氧化酶試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染24 h后開(kāi)始劃痕，PBS輕輕沖洗2次再更換培養(yǎng)液，分別在劃痕后0、48 h時(shí)顯微鏡下照相，觀察細(xì)胞的遷移能力。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

轉(zhuǎn)染過(guò)程同上。G6PD過(guò)表達(dá)組于48 h時(shí)收集細(xì)胞，siRNA干擾實(shí)驗(yàn)組于36 h時(shí)收集細(xì)胞，加入預(yù)冷的75%乙醇4℃固定過(guò)夜，次日將固定好的細(xì)胞以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清液，加入1 ml PBS清洗兩次，離心后加入碘化丙錠（PI）染液，37℃避光染色30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期進(jìn)程。

1.7 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

將大腸癌組織芯片置于65℃烘箱中烘蠟2 h至融化。取出玻片，以二甲苯兩缸，每缸15 min；無(wú)水乙醇兩缸，每缸7 min；90%酒精1缸，5 min；80%酒精1缸，5 min；70%酒精1缸，5 min的梯度進(jìn)行脫蠟。玻片用純水沖洗。檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)。室溫下滴加3%H2O2進(jìn)行阻斷。PBS沖洗后滴加G6PD、HKⅡ抗體4℃孵育過(guò)夜。孵育后的玻片室溫放置30 min后，PBS沖洗加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗，37℃孵育30 min。PBS沖洗后滴加稀釋后的DAB顯色液顯色5 min，自來(lái)水沖洗5 min。滴加哈氏蘇木精對(duì)比染色細(xì)胞核后，以75%酒精1缸，5 min；85%酒精1缸，5 min；95%酒精1缸，5 min；無(wú)水乙醇兩缸，每缸7 min；二甲苯兩缸，每缸15 min的梯度進(jìn)行脫水。取出封片，熒光顯微鏡下觀察免疫組織化學(xué)結(jié)果。

每張切片各選5個(gè)視野，根據(jù)染色程度和染色陽(yáng)性率取均數(shù)進(jìn)行評(píng)分[9]。染色越深即切片陽(yáng)性染色顆粒越多，反映染色陽(yáng)性的G6PD和HKⅡ蛋白表達(dá)水平越高。反之則越低。按染色強(qiáng)度將無(wú)色、淡黃色、棕色、棕褐色分別記為0、1、2、3分。按染色陽(yáng)性率將陽(yáng)性細(xì)胞＜5%、5%～25%、＞25%～50%、＞50%～75%、＞75%分別記為0、1、2、3、4分。以其評(píng)分之積為最終計(jì)算結(jié)果進(jìn)行賦分?？偡?分為陰性（-），1～4分為弱陽(yáng)性（+），5～8分為陽(yáng)性（++），9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的蛋白表達(dá)水平、葡萄糖濃度、細(xì)胞周期及侵襲能力數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),G6PD和HKⅡ在大腸癌與癌旁組織中的表達(dá)水平及其兩者間的相關(guān)性分析均采用Mann-Whitney U-test檢驗(yàn)方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot法檢測(cè)HCT116和SW480細(xì)胞中G6PD過(guò)表達(dá)和干擾效果

在G6PD過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，與Flag轉(zhuǎn)染組相比，HCT116和SW480兩種細(xì)胞Flag-G6PD轉(zhuǎn)染組G6PD蛋白表達(dá)水平顯著升高，見(jiàn)圖1。提示過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)Flag和Flag-G6PD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。在siRNA干擾實(shí)驗(yàn)中，與陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組相比，HCT116和SW480兩種細(xì)胞G6PD-Homo-318轉(zhuǎn)染組無(wú)明顯變化，G6PD-Homo-873和G6PDHomo-1504轉(zhuǎn)染組G6PD蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，而G6PD-Homo-1504轉(zhuǎn)染組下調(diào)更明顯，見(jiàn)圖2。之后的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)我們將利用篩選出的G 6 P DHomo-1504對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干擾。

圖1 過(guò)表達(dá)G6PD后HCT116、SW480細(xì)胞中G6PD的表達(dá)水平Figure 1 Expression levels of G6PD in HCT116 and SW480 cells after overexpression of G6PD

圖2 干擾G6PD后HCT116、SW480細(xì)胞G6PD的表達(dá)水平Figure 2 Expression levels of G6PD in HCT116 and SW480 cells after interference with siRNA

2.2 培養(yǎng)液中葡萄糖含量

在G6PD過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，與Flag轉(zhuǎn)染組相比，F(xiàn)lag-G6PD轉(zhuǎn)染組兩種細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖濃度有所減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。siRNA干擾實(shí)驗(yàn)中，與陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組相比，G6PDHomo-1504轉(zhuǎn)染組兩種細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖濃度顯著升高（PHCT116=0.003,PSW480=0.002），見(jiàn)表1。

表1 過(guò)表達(dá)和干擾G6PD后各組培養(yǎng)液中葡萄糖濃度 (±s,n=3)Table 1 Glucose concentration in culture medium after G6PD overexpression and interference (±s, n=3)

表1 過(guò)表達(dá)和干擾G6PD后各組培養(yǎng)液中葡萄糖濃度 (±s,n=3)Table 1 Glucose concentration in culture medium after G6PD overexpression and interference (±s, n=3)

Notes:#:P＞0.05,compared with Flag transfection group;**:P＜0.01,compared with Negative control transfection group

2.3 過(guò)表達(dá)和干擾G6PD后HCT116、SW480細(xì)胞細(xì)胞周期的變化

G6PD過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，與Flag轉(zhuǎn)染組相比，F(xiàn)lag-G6PD轉(zhuǎn)染組兩種細(xì)胞S期所占比例有所增多，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。siRNA干擾實(shí)驗(yàn)中，與陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組相比G6PD-Homo-1504轉(zhuǎn)染組兩種細(xì)胞S期所占比例明顯減少，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PHCT116=0.02,PSW480=0.03），見(jiàn)圖3。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期的結(jié)果Figure 3 Cell cycle of each group detected by flow cytometry

2.4 過(guò)表達(dá)和干擾G6PD后對(duì)HCT116和SW480細(xì)胞侵襲的影響

G6PD過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)lag轉(zhuǎn)染組與Flag-G6PD轉(zhuǎn)染組兩種細(xì)胞間劃痕部分面積的縮小速率差異無(wú)明顯變化（P＞0.05）。siRNA干擾實(shí)驗(yàn)中，與陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組相比G6PD-Homo-1504轉(zhuǎn)染組兩種細(xì)胞劃痕部分面積的縮小速率明顯降低，說(shuō)明細(xì)胞侵襲能力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PHCT116=0.006,PSW480=0.002），見(jiàn)圖4。

2.5 G6PD與HKⅡ在大腸癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)水平及相關(guān)性分析

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與Flag轉(zhuǎn)染組相比，F(xiàn)lag-G6PD轉(zhuǎn)染組HKⅡ蛋白水平顯著升高，見(jiàn)圖5A～B；siRNA干擾實(shí)驗(yàn)與陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組相比，G6PD-Homo-1504轉(zhuǎn)染組HKⅡ蛋白水平明顯下調(diào)，見(jiàn)圖5C～D。結(jié)果顯示G6PD與HKⅡ可能存在調(diào)控作用。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)89對(duì)大腸癌組織芯片發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，G6PD與HKⅡ在大腸癌組織中表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PG6PD=0.036,PHKⅡ=0.046），見(jiàn)圖5E。通過(guò)Mann-Whitney U test檢驗(yàn)分析，G6PD和HKⅡ在大腸癌組織中的表達(dá)水平存在正相關(guān)（P=1.57×10-4），見(jiàn)圖5F。

圖4 過(guò)表達(dá)和干擾G6PD后兩種細(xì)胞侵襲能力 (×40)Figure 4 Invasion abilities of HCT116 and SW480 cells after G6PD overexpression and interference (×40)

圖5 G6PD和HKⅡ的表達(dá)(A～E)及在大腸癌樣本中的相關(guān)性(F) (×100)Figure 5 Expression of G6PD and HKⅡ(A～E) and their correlation in colorectal cancer samples(F) (×100)

3 討論

葡萄糖代謝的改變是腫瘤細(xì)胞為協(xié)調(diào)葡萄糖的消耗和細(xì)胞生理機(jī)能所產(chǎn)生的一個(gè)顯著的代謝特征。迅速增殖的腫瘤細(xì)胞糖酵解流量通常是正常細(xì)胞的200倍[10]。糖酵解水平的提高使腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗增多，指導(dǎo)更多的葡萄糖進(jìn)入與體內(nèi)生物大分子合成密切相關(guān)的磷酸戊糖途徑。G6PD和HK分別是磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑的關(guān)鍵酶。HKⅠ和HKⅡ在多種腫瘤中高表達(dá)，并且HKⅡ與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系最為密切[11]。以HKⅡ作為治療靶點(diǎn)可以減少體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，包括宮頸癌和肺癌及其他腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的結(jié)果[12-13]。G6PD對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有重要調(diào)節(jié)作用[14]。有研究表明，G6PD是一個(gè)癌基因，在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)[15-16]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大腸癌HCT116和SW480細(xì)胞進(jìn)行過(guò)表達(dá)和干擾G6PD處理。Western blot結(jié)果證實(shí)過(guò)表達(dá)和干擾效果都很顯著。過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，與Flag對(duì)照組相比，F(xiàn)lag-G6PD轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)液中葡萄糖濃度有所降低，S期細(xì)胞數(shù)量有所增多，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而干擾實(shí)驗(yàn)中，與陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組相比，G6PD-Homo-1504轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)液中葡萄糖濃度明顯升高（P＜0.01），消耗的葡萄糖明顯降低，S期細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05）。結(jié)果提示干擾G6PD減少了葡萄糖的消耗，從而抑制了細(xì)胞的增殖。已有研究表明，G6PD與皮膚鱗癌A431細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期密切相關(guān)[17]。本研究劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)G6PD組與對(duì)照組間無(wú)明顯變化（P＞0.05）；而G6PD干擾組細(xì)胞與陰性對(duì)照組相比，侵襲能力顯著降低（P＜0.01），結(jié)果提示我們G6PD可以促進(jìn)細(xì)胞的侵襲。已有研究表明，通過(guò)敲低G6PD造成腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞ccRCC的遷移能力顯著降低[18]。這與我們的結(jié)果相一致。

過(guò)表達(dá)G6PD后葡萄糖的攝取、細(xì)胞周期及侵襲情況變化不顯著。分析其可能原因是腫瘤細(xì)胞中G6PD的表達(dá)水平已經(jīng)足夠維持細(xì)胞需要，雖然細(xì)胞中G6PD總量以及其活性增加，但對(duì)細(xì)胞功能沒(méi)有顯著的影響，這與之前的研究一致[19]。而干擾G6PD后，降低了G6PD的活性，從而減少了細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗，使糖酵解能力降低進(jìn)而抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖和侵襲能力。

同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)G6PD后HKⅡ的表達(dá)水平顯著上調(diào)，siRNA干擾G6PD的表達(dá)后HKⅡ的表達(dá)顯著下調(diào)。提示G6PD與HKⅡ的表達(dá)可能存在調(diào)控作用。因此本研究進(jìn)一步分析了G6PD和HKⅡ在大腸癌組織中的表達(dá)情況。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，大腸癌組織樣本中G6PD與HKⅡ蛋白表達(dá)水平均有明顯升高（P＜0.05）。本研究也證實(shí)：89例大腸癌臨床樣本中有59例G6PD的表達(dá)水平顯著升高，有61例HKⅡ的表達(dá)水平顯著升高。重要的是，本研究證實(shí)了G6PD和HKⅡ在大腸癌組織中表達(dá)水平呈正相關(guān)。與Western blot結(jié)果一致。

綜上所述，干擾G6PD減少了大腸癌細(xì)胞葡萄糖的消耗，抑制了大腸癌細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力；同時(shí)干擾G6PD減少了HKⅡ的表達(dá)，并且與癌旁組織相比，兩者的表達(dá)水平均顯著升高且呈正相關(guān)。因此抑制G6PD和HKⅡ的活性可能為臨床大腸癌患者提供一個(gè)可能的治療策略。關(guān)于兩者之間的具體作用機(jī)制我們正在進(jìn)一步研究之中。