陳志奎，楊菁，謝麗紅

0 引言

胃癌是最常見的消化道腫瘤之一，我國胃癌的發(fā)病率位于癌癥第二位。早期胃癌的5年生存率可達到90%以上，而晚期胃癌失去手術(shù)機會，目前臨床采用化療、靶向治療等綜合治療[1-3]，5年生存率低于20%。腫瘤的消融治療包括射頻、微波、激光、冷凍等多種方法，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床[4-6]。近紅外光熱療（near-infrared photothermal therapy,NIPT）是近年發(fā)展起來的腫瘤局部熱消融方法[7-9]，通過局部注射或靶向結(jié)合等方法，將金納米棒（gold nanorods,GNRs）遞送到腫瘤組織，再通過局部近紅外光照射，使腫瘤局部溫度升高，可達到有效靶向熱消融治療的效果。本研究初步探討金納米棒介導近紅外光熱療對胃癌SGC-7901細胞的殺傷作用及細胞凋亡誘導作用，為其體內(nèi)抗腫瘤研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

人胃癌細胞SGC-7901購自中國醫(yī)學科學院北京細胞庫，于RPMI1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、1%青霉素、鏈霉素），37℃、5% CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。氯金酸、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide,HTAB）、抗壞血酸均為分析純，購自國藥集團上海試劑公司；巰基聚乙二醇購自美國Nanocs公司；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；CCK-8購自東仁化學科技（上海）有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)公司；Caspase-3/-9活性檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)試劑公司；激光器LR-MFJ-808/5000mW，購自長春鐳銳光電科技有限公司；TE2000-U倒置相差熒光顯微鏡購自日本尼康公司；透射電子顯微鏡（TECNAI G2F20）購自美國FEI公司；多功能酶標儀SpectraMax i3x購自奧地利美谷分子公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金納米棒的合成 取5 ml濃度0.2 mol/L的HTAB溶液與5 ml濃度5×10-4mol/L的氯金酸溶液，混合后加入0.6 ml濃度0.1 mol/L的硼氫化鈉，攪拌2 min，形成晶種溶液。將5 ml濃度為0.2 mol/L的HTAB溶液加入到0.2 ml濃度4×10-3mol/L的硝酸銀溶液，再加入5 ml濃度1×10-3的氯金酸溶液，混合后加入70 μl濃度0.0778 mol/L的抗壞血酸溶液，作為生長液。取12 μl晶種溶液加入到生長液中，形成金納米棒。取100 μl濃度5×10-4mol/L的巰基聚乙二醇加入到1 ml金納米棒溶液，攪拌30 s，放入4℃冰箱備用。

1.2.2 金納米棒的表征 取1 ml合成的金納米棒水溶液，超聲分散，取適量樣品溶液，滴加到電子顯微鏡專用銅網(wǎng)上，靜置2 min后，用濾紙小心吸去多余溶液，待銅網(wǎng)自然干燥后，透射電子顯微鏡觀察金納米棒粒徑和形貌。采用多功能酶標儀SpectraMax i3x檢測金納米棒溶液的紫外-可見吸收峰。

1.2.3 金納米棒細胞毒性試驗 胃癌細胞SGC-7901接種于96孔板，每孔100 μl，含1×104細胞，12 h細胞完全貼壁后，加入不同濃度（0、15、30、60、120 μg/ml）金納米棒，作用不同時間（1、3、6、12和24 h）后，采用CCK-8法檢測金納米棒對體外培養(yǎng)胃癌細胞增殖的抑制作用。每孔加入10 μl CCK-8溶液，孵育1 h，采用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的光密度值，根據(jù)公式計算腫瘤細胞生長抑制率（%）=（1-實驗組吸光度平均值/空白對照吸光度平均值）×100%。每組設(shè)3個重復孔。

1.2.4 金納米棒介導近紅外光熱療殺傷胃癌細胞 胃癌細胞SGC-7901接種于96孔板，每孔100 μl，含1×104細胞，12 h后，加入不同濃度（0、5、10、20和40 μg/ml）金納米棒，不同功率（1.0、2.0和3.0 W/cm2）近紅外光照射2 min后，于不同時間（1、3和6 h后），采用CCK-8法檢測金納米棒對體外培養(yǎng)胃癌細胞增殖的抑制作用，方法同上。

1.2.5 金納米棒介導近紅外光熱療誘導胃癌細胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測金納米棒介導近紅外光熱療對體外培養(yǎng)胃癌細胞SCG-7901凋亡的誘導作用。SCG-7901細胞接種于96孔板，每孔100 μl（含1×104個細胞），12 h后加入金納米棒溶液（終濃度20 μg/ml），采用功率為2.0 W/cm2近紅外光照射2 min，在照射后1、3 h兩個時間點采用PBS洗滌2次，加入100 μl 1×Binding Buffer、5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI Staining Solution，輕輕混勻，避光、室溫反應(yīng)10～15 min，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 凋亡相關(guān)酶活性的檢測 以胰酶消化，收集體外培養(yǎng)的SCG-7901細胞，取1 ml細胞懸液（含1×106細胞），置于EP管，加入金納米棒溶液（終濃度20 μg/ml），采用功率為2.0 W/cm2近紅外光垂直照射細胞懸液2 min，600g離心5 min，去除上清液，加入1 ml培養(yǎng)液重懸細胞，靜置培養(yǎng)箱3 h后，按照試劑盒說明書檢測Caspase-3、Caspase-9酶活性，以酶標儀于波長405 nm處的吸光度表示活性變化。設(shè)置陰性對照組，實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 金納米棒的表征

采用透射電子顯微鏡觀察合成金納米棒的粒徑及形貌。金納米棒呈長棒狀，分散良好，大小分布尚均勻，長徑約（53.3±9.3）nm，短徑約（15±3.2）nm，長短徑比值約為（3.5±0.6），見圖1。金納米棒具有一個橫向等離子共振吸收峰和一個縱向等離子共振吸收峰，分別對應(yīng)其橫軸和縱軸兩個特征尺寸，其中縱向等離子共振吸收峰位于790 nm左右，見圖2。

圖1 金納米棒的透射電子顯微鏡圖 (×80 000)Figure 1 Photo of gold nanorods (GNRs) by Transmission electron microscope (×80 000)

2.2 金納米棒的細胞毒性檢測

采用不同濃度的金納米棒作用于體外培養(yǎng)的胃癌SGC-7901細胞，在不同時間點，采用CCK-8法檢測細胞增殖抑制率。較低劑量的金納米棒對SGC-7901細胞無明顯毒性，當GNR濃度達120 μg/ml，孵育24 h時，細胞增殖抑制率達到最高值37.5%，見圖3。

2.3 金納米棒介導近紅外光熱療對SGC-7901細胞殺傷作用

圖2 金納米棒的紫外-可見吸收光譜圖Figure 2 UV-VIS absorption spectra of GNRs

圖3 金納米棒對SGC-7901的細胞毒作用Figure 3 Cytotoxicity of GNRs on SGC-7901 cells

體外培養(yǎng)胃癌SGC-7901細胞生長良好，約3天傳代1次。采用CCK-8法檢測細胞增殖抑制率，結(jié)果顯示，單純近紅外光照射，對胃癌細胞生長無明顯抑制作用，即使加大近紅外光功率到3.0 W/cm2，細胞生長抑制率亦無明顯變化。但金納米棒介導近紅外光熱療具有明顯的抑制腫瘤細胞增殖的作用，隨著金納米棒濃度增加、近紅外光功率升高、處理時間延長，細胞生長抑制率明顯升高，呈現(xiàn)出明顯的時間-劑量依賴效應(yīng)，見表1。

2.4 金納米棒介導近紅外光熱療對SGC-7901細胞凋亡的誘導作用

體外培養(yǎng)的SGC-7901細胞經(jīng)金納米棒介導近紅外光熱療，Annexin V-FITC/PI雙染法可見細胞發(fā)生凋亡，處理1 h后，可見部分細胞表面發(fā)出綠色熒光，處于早期凋亡狀態(tài)；3 h后，細胞發(fā)出紅色熒光，進入中晚期凋亡或死亡狀態(tài)，見圖4。

2.5 凋亡相關(guān)酶活性的檢測

采用分光光度法檢測Caspase-3、Caspase-9酶活性。陰性對照的胃癌SGC-7901細胞Caspase-3、Caspase-9的酶活性分別為（0.21±0.05）、（0.19±0.04），經(jīng)金納米棒介導近紅外光熱療處理后3 h，Caspase-3、Caspase-9酶活性均升高，分別為（0.40±0.07）、（0.45±0.10），與陰性對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.026、0.018）。

表1 金納米棒介導近紅外光熱療對胃癌SGC-7901細胞增殖的抑制作用 (細胞生長抑制率,%)Table 1 Inhibition effects of GNRs-mediated near-infrared photothermal therapy (NIPT) on proliferation of gastric cancer SGC-7901 cells (IR,%)

圖4 金納米棒介導近紅外光熱療1h和3h的SGC-7901細胞凋亡圖Figure 4 Apoptosis photo of SGC-7901 cells treated with GNRs-mediated NIPT for 1h and 3h

3 討論

近年來研究表明，光熱療法是一種具有巨大應(yīng)用前景的腫瘤微創(chuàng)治療方法，其療效明顯，且不良反應(yīng)小，已受到了醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的廣泛重視[10-12]。隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展，金納米棒等在近紅外區(qū)域具有特征吸收的無機納米材料在腫瘤光熱治療、藥物遞送、分子影像中顯示出很高的應(yīng)用價值[13-14]。

金納米棒的局部表面等離子體共振帶包括高能的橫向吸收帶和低能的縱向吸收帶。隨著納米棒縱橫比增加，其光學性質(zhì)發(fā)生改變，縱向表面等離子體共振最大峰偏移到近紅外區(qū)。本研究采用晶種生長法成功合成了金納米棒，透射電子顯微鏡測得長短徑比值為3.5，其縱向等離子共振吸收峰位于790 nm近紅外區(qū)域，并且采用波長808 nm的近紅外光照射，可見溶液溫度明顯升高，進一步證明合成的近納米棒具有明顯吸光發(fā)熱作用。

金元素屬于惰性化學元素，因此金納米粒子被認為是一種比較穩(wěn)定的生物相容性材料之一。然而，研究表明，金納米粒子具有一定的細胞毒性[15]。100 nm以下的金納米粒能自由進出細胞，并且進入細胞器，并可能干擾其功能[16]。金納米粒子的細胞毒性與其濃度、粒徑和形狀等密切相關(guān)。采用晶種生長法合成的金納米棒，其表面存留大量HTAB，具有明顯細胞毒活性。通過對金納米棒進行修飾，采用巰基聚乙二醇置換其表面的HTAB，可明顯降低金納米棒的細胞毒性。本研究采用CCK-8法檢測晶種生長法合成并經(jīng)巰基聚乙二醇修飾的金納米棒對體外培養(yǎng)的胃癌SGC-7901細胞的毒性。CCK-8法操作簡便，檢測敏感度和準確性均很高，重復性好。實驗結(jié)果顯示，低濃度金納米棒對細胞無明顯毒性作用，當提高藥物濃度和孵育時間，120 μg/ml的金納米棒孵育24 h，細胞生長抑制率亦僅為37.5%，表明巰基聚乙二醇修飾的金納米棒毒性明顯降低。

為減少高濃度金納米棒細胞毒性對金納米棒介導近紅外光熱療效果的影響，本研究采用5、10、20、40 μg/ml濃度的金納米棒進行光熱治療實驗，治療后孵育時間設(shè)置為1、3、6 h。單純近紅外光照射對細胞生長抑制不明顯，并且與照射功率亦無明顯相關(guān)，可能本研究采用近紅外光直接照射96孔板，溶液溫度上升速度較慢，幅度較低，而其散熱相對較快，故不足于產(chǎn)生明顯的殺傷胃癌細胞作用。當加入金納米棒，近紅外光照射后，溶液溫度上升速度快，幅度大，細胞生長抑制率明顯下降，當金納米棒濃度為40 μg/ml，3.0 W/cm2近紅外光照射2 min，繼續(xù)孵育1 h后，細胞生長抑制率達到93.4%。比較近紅外光熱療作用1、3、6 h后的細胞生長抑制可以發(fā)現(xiàn)，隨著孵育時間延長，細胞生長抑制率變化逐漸升高，具有一定的時間依賴效應(yīng)。

文獻報道，高溫可破壞癌細胞膜，抑制細胞核酸和蛋白質(zhì)合成，破壞細胞核支架，誘導凋亡基因表達，導致細胞死亡[17-18]。本研究采用Annexin V/PI雙染法檢測近紅外光熱療對胃癌SGC-7901細胞凋亡的誘導作用。Annexin V-FITC可與早期凋亡的細胞脂膜的磷酯酰絲氨酸結(jié)合，發(fā)出綠色熒光；中晚期凋亡及死亡的細胞膜通透性受損，碘化丙啶能透過細胞膜，與核酸結(jié)合，發(fā)出紅色熒光。實驗結(jié)果顯示，近紅外光熱療可明顯誘導胃癌細胞凋亡，在1 h時可見早期凋亡細胞，而3 h后大部分細胞處于中晚期凋亡或死亡狀態(tài)。由此可見，金納米棒介導近紅外光熱療主要通過熱損傷作用抑制胃癌細胞增殖，誘導細胞凋亡。

Caspase半胱氨酸蛋白酶家族在細胞凋亡過程中起著重要作用。Caspase-3處于級聯(lián)反應(yīng)的下游，被認為是細胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，其活化代表細胞凋亡進入不可逆階段[19]。本研究通過分光光度法檢測金納米棒介導近紅外光熱療對胃癌SGC-7901細胞凋亡相關(guān)酶活性的影響。實驗結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，Caspase-3、Caspase-9酶活性均升高約1倍，進一步表明金納米棒介導近紅外光熱療可通過活化Caspase誘導胃癌細胞凋亡。

綜上所述，采用晶種生長法合成并經(jīng)巰基聚乙二醇修飾的金納米棒具有明顯的吸光發(fā)熱作用，并且細胞毒性低。金納米棒介導近紅外光熱療具有顯著的抑制胃癌細胞增殖作用，并且該療效具有明顯的劑量依賴效應(yīng)。金納米棒介導近紅外光熱療可通過活化Caspase誘導胃癌細胞凋亡，這可能是其抑制胃癌細胞增殖的主要作用機制之一。