王開瓊，邢貽雷，喬欣，李仕總，宮東偉，余智威，吳奕強(qiáng)

0 引言

胰腺癌是一種惡性程度較高且預(yù)后較差的實(shí)體瘤，其具有較強(qiáng)的侵襲能力，患者確診時已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移從而導(dǎo)致患者死亡率逐年升高[1]。探討胰腺癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移機(jī)制對早期診斷及治療均具有重要意義。隨著生物信息技術(shù)發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)微小RNA（microRNA,miRNA）可通過調(diào)控靶基因表達(dá)進(jìn)而參與基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)過程，其中部分miRNA還可通過抑制靶基因表達(dá)進(jìn)而參與多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程[2]。相關(guān)研究表明微小RNA-144（miRNA-144,miR-144）在乳腺癌組織及細(xì)胞中均呈低表達(dá)，其可通過負(fù)向調(diào)控靶基因CEP55表達(dá)進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移[3]。同時研究發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（phosphoinositide-3kinase/protein kinase B,PI3K/Akt）信號通路激活后可增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞增殖及侵襲能力[4]。關(guān)于miR-144在胰腺癌中表達(dá)及其潛在作用機(jī)制的研究鮮見報道，因此本研究初步探討miR-144對胰腺癌SW1990細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲的影響，并分析其對PI3K/Akt信號通路的影響，旨在為揭示胰腺癌發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人正常胰腺上皮細(xì)胞系HPDE、胰腺癌細(xì)胞系SW1990均購于中國上海中科院細(xì)胞庫，將其凍存于-80℃冰箱。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)基購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；鼠抗人PI3K、p-PI3K、Akt和磷酸化蛋白（phospho-protein kinase,p-Akt）多克隆抗體均選購自美國R&D公司；RNA提取試劑盒、RT-qPCR檢測試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；蛋白提取試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；熒光定量PCR儀器購自德國Eppendorf公司；蛋白凝膠成像儀購自美國Bio-Red公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取出凍存的HPDE和SW1990細(xì)胞，將其進(jìn)行水?。?7℃），離心后棄上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37℃、5%CO2），細(xì)胞生長至80%時棄培養(yǎng)基，PBS清洗，0.2%胰酶消化5 min，細(xì)胞培養(yǎng)至第3代時可用于后續(xù)研究。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 取對數(shù)期細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前1 h將培養(yǎng)液替換為Opti-MEM減血清培養(yǎng)基，參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將miR-144陰性對照質(zhì)粒、miR-144 mimic質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至SW1990細(xì)胞，其中miR-144陰性對照質(zhì)粒、miR-144 mimic質(zhì)粒均由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成，分別命名為陰性轉(zhuǎn)染組、miR-144過表達(dá)組，未經(jīng)處理的細(xì)胞命名為空白對照組，轉(zhuǎn)染后將其置于培養(yǎng)箱中（37℃、5%CO2）培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞上清液待測。

1.3.3 RT-qPCR檢測miR-144表達(dá)水平 按照RNA試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用RT-qPCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時熒光定量反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μl:SYBR Premix 10 μl，cDNA 1 μl，H2O 8 μl，上下游引物各0.5 μl。反應(yīng)程序：95℃ 20 s，95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 10 s，共40個循環(huán)。miR-144以U6作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-144的相對表達(dá)量。

1.3.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況 轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h收集細(xì)胞，將其接種至細(xì)胞培養(yǎng)板，分別在12、24、48和72 h加入CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，收集細(xì)胞，使用全自動酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下各孔細(xì)胞吸光度值（OD）。細(xì)胞增殖率=OD實(shí)驗(yàn)組均值/OD空白組均值×100%。

1.3.5 平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測菌落形成 收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的對數(shù)期細(xì)胞并將其接種于96孔板中，孵育24 h（37℃、5%CO2），PBS清洗，加入4%甲醛（甲硫醇:冰醋酸=7:1）固定15 min，采用含0.1%結(jié)晶紫溶液染色30 min，水洗干燥后拍照計(jì)數(shù)克隆形成個數(shù)。

1.3.6 Transwell檢測細(xì)胞遷移能力 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞饑餓培養(yǎng)24 h，制備單細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞密度調(diào)整為5×104個/毫升，在Transwell小室上室內(nèi)加入200 μl單細(xì)胞懸浮液（1×104個/孔），下室添加500 μl胎牛血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后取出小室，用棉簽清理未遷移細(xì)胞并利用多聚甲醛固定，采用吉姆薩法染色15 min，隨機(jī)選取5個視野在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì)算平均值。

1.3.7 Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h后制備單細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞密度調(diào)整為5×104個/毫升，在小室上室內(nèi)（已被Matrigel基質(zhì)膠包被）加入200 μl細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)為1×104個/孔），下室中加入500 μl胎牛血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，PBS清洗，加入多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫溶液染色2 h，PBS清洗后在光學(xué)顯微鏡下計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)量。

1.3.8 Western blot法檢測PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)水平 采用RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，采用12%SDS-PAGE電泳分離等量蛋白，將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后分別加入PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt一抗（1:500），4℃孵育，次日分別加入二抗（1:5000），室溫孵育1 h，均以β-actin為內(nèi)參，ECL發(fā)光試劑顯影，采用Quantity One軟件評估PI3K、Akt、p-Akt蛋白相對表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，各組數(shù)據(jù)均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPDE、SW1990細(xì)胞系中miR-144及轉(zhuǎn)染后miR-144的表達(dá)水平

與HPDE細(xì)胞（1.04±0.17）相比，SW1990細(xì)胞（0.48±0.08）中miR-144的表達(dá)水平顯著降低（t=7.301,P=0.0001）。與空白對照組（0.98±0.16）、陰性轉(zhuǎn)染組（1.01±0.17）相比，miR-144過表達(dá)組（3.92±0.65）中miR-144表達(dá)水平顯著升高（F=107.626,P=0.0001）。

2.2 細(xì)胞增殖情況

隨著細(xì)胞培養(yǎng)時間延長，miR-144過表達(dá)組細(xì)胞增殖率逐漸降低，同一時間內(nèi)miR-144過表達(dá)組細(xì)胞增殖率均顯著低于空白對照組、陰性轉(zhuǎn)染組（P＜0.05），見表1。

2.3 細(xì)胞菌落、遷移及侵襲情況

與空白對照組、陰性轉(zhuǎn)染組相比，miR-144過表達(dá)組細(xì)胞菌落、遷移、侵襲數(shù)量均顯著降低（均P＜0.05），見圖1～2、表2。

2.4 細(xì)胞中PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)情況

與空白對照組、陰性轉(zhuǎn)染組相比，miR-144過表達(dá)組p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)水平均顯著降低（均P＜0.05），見圖3、表3。

圖1 過表達(dá)miR-144后細(xì)胞菌落形成情況Figure 1 Cell colony formation after miR-144 was overexpressed

表1 過表達(dá)miR-144后各組SW1990細(xì)胞增殖率比較 (±s)Table 1 Comparison of proliferation rate of SW1990 cell with miR-144 overexpression among three groups (±s)

表1 過表達(dá)miR-144后各組SW1990細(xì)胞增殖率比較 (±s)Table 1 Comparison of proliferation rate of SW1990 cell with miR-144 overexpression among three groups (±s)

Note:*:P＜0.05,compared with Control and Negative transfection group

表2 過表達(dá)miR-144后細(xì)胞菌落、遷移、侵襲數(shù)量比較 (n,±s)Table 2 Comparison of colony,migration and invasion of SW1990 cells with miR-144 overexpression (n,±s)

表2 過表達(dá)miR-144后細(xì)胞菌落、遷移、侵襲數(shù)量比較 (n,±s)Table 2 Comparison of colony,migration and invasion of SW1990 cells with miR-144 overexpression (n,±s)

Note:*:P＜0.05,compared with Control and Negative transfection group

3 討論

胰腺癌患者發(fā)病初期臨床癥狀不明顯，大部分患者確診時已處于胰腺癌晚期并導(dǎo)致手術(shù)治療失敗率增加[5]。由于胰腺癌早期易發(fā)生遠(yuǎn)處侵襲及轉(zhuǎn)移導(dǎo)致患者預(yù)后較差，故而從分子水平揭示其侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要意義[6]。研究表明部分miRNA可在胰腺癌組織中呈高表達(dá)，并可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力[7-8]。另有研究表明PI3K/Akt信號通路與癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲有關(guān)，抑制PI3K/Akt信號通路可有效抑制癌細(xì)胞增殖并促使其細(xì)胞周期發(fā)生阻滯從而促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[9]。因此，本研究主要分析miR-144對胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力的影響，同時研究miR-144對PI3K通路的作用及其影響。

圖2 過表達(dá)miR-144后細(xì)胞遷移、侵襲情況 (×100)Figure 2 Cell migration and invasion after miR-144 was overexpressed (×100)

圖3 過表達(dá)miR-144后PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)情況Figure 3 Expression of PI3K,Akt and p-Akt proteins in SW1990 cells with miR-144 overexpression

miR-144可通過下調(diào)靶基因TIGAR表達(dá)進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞增殖，還可通過影響Wnt等信號通路對肺鱗癌發(fā)生及發(fā)展發(fā)揮調(diào)控作用[10-11]。Ren等研究表明miR-144在胃癌中呈低表達(dá)，同時其可促使靶基因RLIP76表達(dá)水平降低進(jìn)而發(fā)揮抑癌基因作用[12]。Han等研究發(fā)現(xiàn)miR-144可通過調(diào)控CXC趨化因子配體11表達(dá)進(jìn)而參與結(jié)直腸癌發(fā)生及發(fā)展過程[13]。關(guān)于miR-144在胰腺癌中的表達(dá)研究尚未見報道，本研究結(jié)果顯示SW1990細(xì)胞系中miR-144表達(dá)水平顯著低于HPDE細(xì)胞系，說明胰腺癌細(xì)胞中miR-144呈低表達(dá)，提示miR-144在胰腺癌發(fā)生及發(fā)展中可能發(fā)揮抑癌基因作用。另有研究顯示miR-144過表達(dá)后可通過抑制靶基因RUX1表達(dá)進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞增殖及遷移[14]。胃癌組織及細(xì)胞中miR-144過表達(dá)時可通過靶基因環(huán)氧合酶-2表達(dá)水平進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞增殖及遷移并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示胰腺癌細(xì)胞SW1990中miR-144過表達(dá)組miR-144表達(dá)水平顯著高于空白對照組、陰性轉(zhuǎn)染組，且miR-144過表達(dá)組細(xì)胞增殖率顯著低于空白對照組、陰性轉(zhuǎn)染組，此外，miR-144過表達(dá)組細(xì)胞菌落、遷移、侵襲數(shù)量均顯著低于空白對照組、陰性轉(zhuǎn)染組，說明胰腺癌細(xì)胞SW1990中miR-144過表達(dá)后，細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力顯著降低，提示miR-144可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

表3 過表達(dá)miR-144后PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)情況 (±s)Table 3 Expression of PI3K,Akt and p-Akt proteins in SW1990 cells with miR-144 overexpression (±s)

表3 過表達(dá)miR-144后PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)情況 (±s)Table 3 Expression of PI3K,Akt and p-Akt proteins in SW1990 cells with miR-144 overexpression (±s)

Note:*:P＜0.05,compared with control and negative transfection group

腫瘤遷移及侵襲與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）密切相關(guān)，研究表明PI3K/Akt通路激活后可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞及癌細(xì)胞中VEGF水平顯著增加，可通過抑制VEGF表達(dá)并影響PI3K/Akt信號通路進(jìn)而抑制癌細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移[16-17]。相關(guān)研究表明上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子C（VEGFC）與血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）可激活PI3K/Akt通路進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲、遷移[18-19]。Tao等研究發(fā)現(xiàn)miR-144可通過調(diào)控靶基因VEGFC及VEGFA表達(dá)進(jìn)而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖及遷移[20]。以上研究結(jié)果提示胰腺癌細(xì)胞中miR-144表達(dá)對PI3K/Akt信號通路具有一定影響。本研究結(jié)果顯示miR-144過表達(dá)組p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)水平均顯著低于空白對照組、陰性轉(zhuǎn)染組，說明胰腺癌SW1990細(xì)胞中miR-144可影響p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)，提示miR-144表達(dá)可影響胰腺癌PI3K/Akt信號通路，其可能作用機(jī)制為miR-144通過負(fù)向調(diào)控靶基因VEGFC、VEGFA表達(dá)并影響PI3K/Akt信號通路進(jìn)而抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

綜上，miR-144在胰腺癌SW1990細(xì)胞中呈低表達(dá)，其可能通過影響PI3K/Akt信號通路進(jìn)而影響胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，為胰腺癌的治療提供新方向。本研究存在不足之處，關(guān)于胰腺癌中miR-144與PI3K/Akt信號通路的具體作用機(jī)制及其他通路相關(guān)蛋白的具體調(diào)控過程，需深入研究進(jìn)行驗(yàn)證。