陳曉琳 ，張夢(mèng)琳，昌牧雨，方茂成，黃楚晴，邱小燕，鄧鑫州，柯青，段奇文，駱志國(guó)

0 引言

放療是非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）常見(jiàn)治療方法，資料顯示，約60%的患者在治療不同階段會(huì)接受放療[1-2]。然而，電離輻射可引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transitions,EMT）[3-4]，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。

姜黃素（Curcumin）是從姜黃、菖蒲、莪術(shù)、郁金等姜科或者天南星科的部分植物根莖中提取的一種純天然的淡黃色酚類色素[5]。大量研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可抑制胰腺癌、膀胱癌及腎癌等細(xì)胞EMT的發(fā)生[6-8]。但姜黃素是否能夠逆轉(zhuǎn)放療誘導(dǎo)的NSCLC發(fā)生EMT，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。

本研究擬通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討姜黃素對(duì)電離輻射誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，為抑制或減輕臨床上放療誘導(dǎo)的NSCLC腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；姜黃素（貨號(hào)08511）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；抗pan-Keratin（貨號(hào)4545）、E-cadherin（貨號(hào)14472）、N-cadherin（貨號(hào)13116）、Vimentin（貨號(hào)5741）抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；GAPDH一抗（貨號(hào)ANT011）及HRP標(biāo)記二抗（貨號(hào)ANT019）購(gòu)自武漢安特捷生物技術(shù)有限公司；蛋白裂解液、PMSF、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自南通碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 細(xì)胞株

人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.3 儀器及設(shè)備

Transwell小室（Corning公司，美國(guó)）；Fresco21 型冷凍高速離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó)）；CKX41型倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；MP-4型電泳儀及轉(zhuǎn)印槽（Bio-Rad公司，美國(guó)）；odyssey-SA型雙色紅外激光成像系統(tǒng)（上海儀濤生物儀器有限公司）；ELX800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Biotek公司，美國(guó)）；Elekta Synergy直線加速器（Elekta公司，瑞典）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2的條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.5 電離輻射誘導(dǎo)EMT

用2、4、6、8、10 Gy的X射線照射A549細(xì)胞，誘導(dǎo)其發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，命名為A549R。每照射一次，待細(xì)胞恢復(fù)活力，能正常傳代后進(jìn)行下一次照射，鋪板密度為50%。

1.6 CCK8法檢測(cè)姜黃素對(duì)A549R細(xì)胞增殖的影響

選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549R細(xì)胞，分別以5×103個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，第二天將陳舊培養(yǎng)基吸除，分別加入含姜黃素終濃度為0、1、5、10、20、40、60、100、200 μmol/L的DMEM完全培養(yǎng)基，處理48 h后，吸棄舊培養(yǎng)基，向每孔中加入含10 μl CCK-8試劑的新鮮培養(yǎng)基，孵育2 h，用Thermo Varioskan Flash多功能讀數(shù)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm處細(xì)胞的OD值。實(shí)際OD值=測(cè)量OD值-背景OD值。SPSS18.0軟件計(jì)算姜黃素的IC50。

1.7 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)

收集細(xì)胞（約5×106個(gè)），按照試劑盒說(shuō)明書提取蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取20 μg總蛋白用10% SDS-PAGE膠電泳，轉(zhuǎn)膜后置于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h。一抗4°C孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h，采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。以ImagePro Plus 7.0圖像分析軟件計(jì)算灰度值，將目的蛋白與內(nèi)參蛋白兩者灰度值的比值作為目的蛋白的表達(dá)量。

1.8 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

將A549R細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種7×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至融合時(shí)（約24 h），用10 μl的槍頭在細(xì)胞層上劃出一道劃痕，PBS清洗3次，加入含0.1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于顯微鏡下捕捉0 h劃痕圖片，每組捕捉10張，待培養(yǎng)48 h后，使用顯微鏡在上次捕捉位置再進(jìn)行拍照。National Instrument Vision Assistant 8.6軟件計(jì)算劃痕傷口愈合面積，愈合面積=0 h劃痕面積-48 h劃痕面積。

1.9 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

將細(xì)胞濃度調(diào)整至3×105/ml，每個(gè)Transwell小室的上室加入細(xì)胞懸液100 μl，下室加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，培養(yǎng)細(xì)胞12 h后，用棉簽擦去膜上層細(xì)胞，使用PBS淋洗后在室溫下用甲醇固定膜下層細(xì)胞15 min。PBS清洗3次后結(jié)晶紫染色，顯微鏡照相，捕捉圖片，計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用完全隨機(jī)方差分析或t檢驗(yàn)，經(jīng)SPSS16.0軟件計(jì)算相應(yīng)P值。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A549細(xì)胞經(jīng)電離輻射后細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)形態(tài)

A549細(xì)胞經(jīng)梯度分割電離輻射后，細(xì)胞形態(tài)由橢圓形上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N形間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，見(jiàn)圖1。上述結(jié)果表明，已經(jīng)成功構(gòu)建了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化模型A549R。

圖1 A549細(xì)胞經(jīng)分割電離輻射后的形態(tài)變化 (×200,比例尺:100 μm)Figure 1 Morphological changes of A549 cells after fractionated ionizing radiation (×200,Bar:100 μm)

2.2 A549R細(xì)胞上皮及間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)變化水平

為進(jìn)一步明確經(jīng)過(guò)分割電離輻射處理的A549細(xì)胞是否發(fā)生了EMT，用Western blot法檢測(cè)了A549和A549R上皮及間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)差異，結(jié)果顯示：上皮標(biāo)志物角蛋白（pan-Keratin）表達(dá)顯著下調(diào)（F=0.743,P=0.034）；E鈣黏蛋白（Ecadherin）（F=0.987,P=0.002）、間質(zhì)標(biāo)志物N鈣黏蛋白（N-cadherin）（F=0.400,P=0.010）、波形蛋白（Vimentin）表達(dá)顯著上調(diào)（F=0.710,P=0.024）；Twist表達(dá)輕微上調(diào)，見(jiàn)圖2。

2.3 檢測(cè)姜黃素對(duì)A549R細(xì)胞抑制的IC50

用0、1、5、10、20、40、60、100、200 μmol/L的姜黃素處理A549R細(xì)胞48 h，CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖的情況，結(jié)果顯示，40 μmol/L的姜黃素可顯著抑制A549R細(xì)胞的增殖，見(jiàn)圖3，計(jì)算其IC50為34.54 μmol/L。

2.4 姜黃素逆轉(zhuǎn)A549R間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)

為了檢測(cè)姜黃素對(duì)A549R細(xì)胞形態(tài)的影響，用0、1、2、5、10、20 μmol/L姜黃素處理A549R細(xì)胞48 h，A549R細(xì)胞形態(tài)由紡錘形間質(zhì)形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闄E圓形上皮形態(tài)，見(jiàn)圖4。其中，姜黃素濃度為20 μmol/L時(shí)最為顯著。

2.5 姜黃素對(duì)A549R細(xì)胞上皮/間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)的影響

圖2 Western blot檢測(cè)A549和A549R上皮/間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)水平的變化Figure 2 Expression levels of epithelial and mesenchymal markers in A549 and A549R cells detected by Western blot

圖3 姜黃素對(duì)A549R細(xì)胞抑制的IC50測(cè)定Figure 3 IC50of curcumin on A549R cells

經(jīng)過(guò)20 μmol/L姜黃素處理，上皮標(biāo)志物E-cadherin（F=0.658,P=0.028）、間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin（F=0.550,P=0.016）、Twist表達(dá)顯著下調(diào)（F=0.751,P=0.010），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；pan-Keratin表達(dá)上調(diào)（F=0.225,P=0.048），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；N-cadherin表達(dá)水平無(wú)明顯變化（F=0.558,P=0.865），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果表明姜黃素可能逆轉(zhuǎn)了A549R細(xì)胞EMT，見(jiàn)圖5。

2.6 姜黃素抑制A549R細(xì)胞劃痕愈合能力

細(xì)胞發(fā)生EMT 的一個(gè)重要結(jié)果就是促進(jìn)細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移。為了驗(yàn)證姜黃素是否能夠影響A549R細(xì)胞的遷移能力，進(jìn)行了劃痕愈合實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：1 μmol/L姜黃素并未顯著影響劃痕愈合，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.944,P=0.909）；2 μmol/L（F=0.972,P=0.018）、5μmol/L（F=0.678,P=0.003）、10 μmol/L（F=0.995,P=0.000）、20 μmol/L（F=0.401,P=0.000）的姜黃素處理后，愈合面積隨姜黃素濃度的升高而顯著降低，見(jiàn)圖6。這表明姜黃素可顯著抑制A549R細(xì)胞的遷移能力。

圖4 光學(xué)顯微鏡觀測(cè)姜黃素對(duì)A549R細(xì)胞形態(tài)的影響(×200)Figure 4 Effect of curcumin on morphology of A549R cells observed by optical microscope(×200)

圖5 Western blot檢測(cè)姜黃素對(duì)A549R細(xì)胞上皮/間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)的逆轉(zhuǎn)作用Figure 5 Reversal effects of curcumin on expression of epithelial and mesenchymal markers in A549R cells detected by Western blot

2.7 姜黃素抑制A549R細(xì)胞遷移能力

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:1 μmol/L姜黃素并未顯著影響細(xì)胞遷移能力，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.751,P=0.766）；2 μmol/L（F=0.503,P=0.002）、5 μmol/L（F=0.861,P=0.001）、10 μmol/L（F=0.861,P=0.000）、20 μmol/L（F=0.503,P=0.000）的姜黃素處理后，細(xì)胞遷移能力顯著下降，且遷移能力隨姜黃素濃度的升高而顯著下降，見(jiàn)圖7。進(jìn)一步表明姜黃素可顯著地抑制A549R細(xì)胞的遷移能力。

3 討論

肺癌是世界上發(fā)病率及死亡率較高的惡性腫瘤之一，其中NSCLC發(fā)病率占肺癌總數(shù)的80%～85%[9]。放療是NSCLC的常見(jiàn)治療方法。然而，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，電離輻射可引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而獲得高遷移和侵襲能力，形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶[3]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)分割輻射處理的NSCLC A549細(xì)胞形態(tài)由不利于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的橢圓形轉(zhuǎn)變?yōu)橛欣谀[瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的紡錘形間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，其上皮/間質(zhì)標(biāo)志物pan-Keratin、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Twist表達(dá)水平也顯著下調(diào)或上調(diào)，提示NSCLC放療有增加腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于NSCLC患者來(lái)說(shuō)，腫瘤轉(zhuǎn)移是影響其長(zhǎng)期生存的最大危險(xiǎn)因素之一，因此，探尋放療誘導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制及逆轉(zhuǎn)策略是當(dāng)前要重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題。

姜黃素在逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[5-6,10]。本研究證實(shí)，姜黃素能夠顯著逆轉(zhuǎn)放療誘導(dǎo)的NSCLC A549細(xì)胞發(fā)生EMT，經(jīng)姜黃素處理后，A549R細(xì)胞形態(tài)由紡錘形間質(zhì)形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闄E圓形上皮形態(tài)，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin無(wú)變化、Vimentin、Twist表達(dá)顯著下調(diào)，上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)也發(fā)生下調(diào)。E-cadherin作為一個(gè)上皮標(biāo)志物在發(fā)生EMT過(guò)程表達(dá)會(huì)下調(diào),然而在本研究中細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著EMT的A549R細(xì)胞E-cadherin卻顯著上調(diào)，經(jīng)過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，我們確認(rèn)結(jié)果無(wú)誤。通過(guò)查閱大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)E-cadherin是鈣黏素家族中的一員，分子量約為120 kD，屬于鈣依賴性跨膜糖蛋白，在上皮細(xì)胞多有表達(dá)[11]。E-cadherin作為一種細(xì)胞膜蛋白，在α-分泌酶ADAMs、基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs、激肽釋放酶7等共同催化作用下，將成熟的E-cadherin剪切成N端80 kD胞外片段（可溶性E-cadherin，sEcadherin）和C端38 kD胞內(nèi)片段[12]。sE-cadherin在NSCLC患者血清中含量明顯髙于正常組，且與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移正相關(guān)[13]。因此，E-cadherin對(duì)細(xì)胞遷移和（或）轉(zhuǎn)移的作用可能是復(fù)雜的，本研究中E-cadherin在A549細(xì)胞發(fā)生EMT過(guò)程中表達(dá)上調(diào)可能并不是一種矛盾現(xiàn)象。在經(jīng)典的EMT現(xiàn)象中E-cadherin表達(dá)下調(diào)，而本研究發(fā)現(xiàn)的可能是一種新的、非經(jīng)典的EMT現(xiàn)象，將為重新審視EMT標(biāo)志物，以及E-cadherin在EMT中的作用提供重要學(xué)術(shù)參考價(jià)值。由于本研究未對(duì)其進(jìn)行深入的功能和機(jī)制研究，此種EMT現(xiàn)象與經(jīng)典的EMT現(xiàn)象的功能和分子機(jī)制差異還不清楚。

圖6 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)姜黃素對(duì)A549R細(xì)胞遷移能力的影響 (×200，比例尺:100 μm)Figure 6 Effects of curcumin on migration ability of A549R cells detected by scratch healing assay (×200,Bar:100 μm)

圖7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)姜黃素對(duì)A549R細(xì)胞遷移能力的影響 (×200，比例尺:100 μm)Figure 7 Effects of curcumin on migration of A549R cells detected by Transwell assay (×200,Bar:100 μm)

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了一種非經(jīng)典的EMT現(xiàn)象，結(jié)果顯示姜黃素通過(guò)下調(diào)E-cadherin、Vimentin、Twist的表達(dá)，并上調(diào)pan-Keratin的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)電離輻射誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞發(fā)生EMT，有望為克服臨床上電離輻射誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞發(fā)生EMT提供了一種新思路。