張興彩，蔡余力，張偉，陳憲海

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肺病科，山東 濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)骨科，山東 濟(jì)南 250014)

特發(fā)性肺纖維化(IPF)是由慢性的上皮細(xì)胞損傷，纖維細(xì)胞異?；钴S造成的，而吡非尼酮作為IPF治療的新晉推薦藥物，具有抗炎、抗氧化及抗纖維化的作用，但吡非尼酮調(diào)節(jié)纖維增生的機(jī)制至今尚未完全清楚，其生物學(xué)活性可能是多靶點(diǎn)的。槲皮素是一種黃酮類化合物，存在于多種具有抗纖維化作用的草藥中。我們的先期研究發(fā)現(xiàn)槲皮素通過(guò)抑制SphK1/S1P信號(hào)在體內(nèi)和體外均可改善肺纖維化[1]。有研究表明，S1P/SphK1通過(guò)與多種細(xì)胞作用參與促纖維炎癥及纖維化的過(guò)程，其中包括改變血管通透性、白細(xì)胞浸潤(rùn)、遷移、成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的分化增殖[2-3]。本研究初步探討吡非尼酮抗肺纖維化作用是否與調(diào)節(jié)S1P/SphK1信號(hào)通路有關(guān)，并與槲皮素進(jìn)行比較，為臨床用藥提供更多的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 藥物及儀器

博來(lái)霉素：購(gòu)自日本株式會(huì)社，規(guī)格：15 mg/支。吡非尼酮原料藥：購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司。槲皮素原料購(gòu)自中國(guó)上海阿拉丁生物技術(shù)有限公司。試劑：0．5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液；鞘氨醇-1-磷酸(S1P)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)購(gòu)自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，貨號(hào)CEG031Ge。ExicyclerTM 96熒光定量?jī)x(韓國(guó)BIONEER公司)，凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)。

1.2 動(dòng)物造模及給藥

選擇成年雄性C57BL/6小鼠，8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，隨機(jī)分為4組,每組20只(對(duì)照組A，博來(lái)霉素組B，博來(lái)霉素+吡非尼酮組C，博來(lái)霉素+槲皮素組D)。除對(duì)照組外，其余3組小鼠經(jīng)氣管滴注博來(lái)霉素(10 mg/kg，溶于100 μL生理鹽水)誘導(dǎo)肺纖維化，對(duì)照組給予同劑量生理鹽水。造模當(dāng)天為第0天，從第1天開(kāi)始，C組小鼠每天灌胃給藥吡非尼酮(200 mg/kg，溶于0.5% CMC-Na溶液中)，D組小鼠每天灌胃給藥槲皮素(100 mg/kg)200 μL共給藥20 d，對(duì)照組和博來(lái)霉素組灌胃給予同劑量0.5% CMC-Na溶液。第21天，各組小鼠摘除眼球取血后腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉過(guò)量麻醉致死,取肺組織，部分肺組織固定于10%中性甲醛溶液中，部分肺組織液氮速凍轉(zhuǎn)至-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 小鼠肺間質(zhì)纖維化模型病理學(xué)觀察

行HE染色和Masson染色，分別于100倍和400倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察肺組織肺泡炎和肺纖維化程度。

1.4 Real-time PCR檢測(cè)各組小鼠肺組織中鞘氨醇磷酸化酶1(SphK1)mRNA表達(dá)水平

步驟遵循試劑盒說(shuō)明書(shū),利用總RNA提取試劑盒提取樣本總RNA, 將得到的RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到對(duì)應(yīng)的cDNA，PCR反應(yīng)體系包括：cDNA模板1 μL，上下游引物(10 μM)各0.5 μL，SYBR GREEN mastermix 10 μL，用ddH2O補(bǔ)足至20 μL，采用 Prime Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)中所用到的引物如下:小鼠Sphk1(forward 5′-ACGAGCAG GTGACTAATGAAGA-3′,reverse 5′-GTGCCCACTGTGAAACGAA-3′),內(nèi)參GAPDH(forward 5′-GGACGCATTGGTCGTCTGG-3′，reverse 5′-TTTGCACTGGTACGTGT TGAT-3′)本實(shí)驗(yàn)利用韓國(guó)BIONEER公司生產(chǎn)的ExicyclerTM 96熒光定量?jī)x進(jìn)行熒光定量分析,每種樣本每個(gè)基因進(jìn)行4個(gè)復(fù)孔平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的選取，舍去誤差較大的數(shù)值，取剩余數(shù)值的平均值作為最終實(shí)驗(yàn)保留數(shù)據(jù)，結(jié)果數(shù)據(jù)采用方程2- △△ CT計(jì)算目的基因的表達(dá)水平。

1.5 Western-blot檢測(cè)各組小鼠肺組織中fibronectin(FN)、α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和SphK1蛋白表達(dá)水平

根據(jù)每個(gè)樣本的質(zhì)量及體積加入相應(yīng)體積的RIPA裂解液，裂解樣本，然后繼續(xù)置于冰上靜置5 min。低溫冷凍離心機(jī)，10 000 r/min，4℃，離心10 min，分離上清為所得的蛋白質(zhì)抽提物。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度，取總蛋白含量為40 μg/孔上樣，進(jìn)行SDS-PAGE約2.5 h，電轉(zhuǎn)移于PVDF膜上(電壓80 V轉(zhuǎn)印1.5 h) 上，用5%(M/V)脫脂奶粉稀釋抗體，制成抗體工作液。一抗4℃孵育過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)中所孵育的一抗分別為：fibronectin antibody(1：300,BOSTER,BA1771,中國(guó))α-SMA antibody(1：500，BOSTER，BM4172，中國(guó))Collagen I antibody(1：500 ，Bioss，bs-7158R，中國(guó)) Collagen III antibody(1：500 ，BOSTER，BM1625，中國(guó)) Sphk1 antibody(1：300，BOSTER，BA2865，中國(guó))次日TBST洗膜洗4次，每次5 min，分別加入相應(yīng)二抗Fibronectin,α-SMA,Collagen I,Sphk1二抗為羊抗兔IgG-HRP(1：5000，碧云天，A0208，中國(guó))Collagen III 二抗為羊抗小鼠IgG-HRP(1：5000，碧云天，A0216，中國(guó))37℃孵育45 min，TBST洗膜洗6次，每次5 min，后加入化學(xué)發(fā)光試劑,X 線膠片曝光。同時(shí)以內(nèi)參GAPDH 進(jìn)行對(duì)照，染色方法同上。將膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.6 ELISA試劑盒檢測(cè)各組小鼠血清和肺組織中1-磷酸鞘氨醇(S1P)表達(dá)水平

根據(jù)組織重量和PBS1:9勻漿。10 000 r/min,離心10 min，上清為實(shí)驗(yàn)所需蛋白樣品，血清1 000 r/min 離心10 min，取上清即可檢測(cè)。參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行試驗(yàn)，以空白孔調(diào)零，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)，依序測(cè)量各孔吸光度。每孔設(shè)3個(gè)平行孔，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，OD值為橫坐標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析進(jìn)行t檢驗(yàn)以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色及Masson染色觀察各組小鼠肺部損傷情況

結(jié)果顯示，10 mg/kg博來(lái)霉素經(jīng)氣管滴注給藥，可引起小鼠肺組織嚴(yán)重?fù)p傷且出現(xiàn)嚴(yán)重的纖維化程度，如圖1A、B所示。HE染色于100倍、400倍光鏡下觀察博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺組織內(nèi)的病理以炎性滲出、肺泡炎為主，炎性細(xì)胞總數(shù)多，以中性粒細(xì)胞為主，可見(jiàn)成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)沉積，肺泡壁和肺泡間隔增厚明顯，肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，這也驗(yàn)證了10 mg/kg博來(lái)霉素誘導(dǎo)IPF小鼠模型建立成功， Masson染色病理學(xué)觀察博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺組織內(nèi)在胸膜下、大氣道及血管壁周?chē)纳钏{(lán)色基質(zhì)膠原明顯增多，有大量纖維組織增生，而吡非尼酮與槲皮素均可以減輕這些損傷，起到保護(hù)肺臟的作用，其中槲皮素鏡下改善表現(xiàn)更加突出。

2.2 小鼠肺組織中纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)

博來(lái)霉素顯著增加小鼠肺組織中纖維化相關(guān)蛋白FN，α-SMA，Collagen I, Collagen III的表達(dá)量，從分子水平上提示博來(lái)霉素誘導(dǎo)IPF小鼠模型建立成功，而吡非尼酮，槲皮素均可有效抑制肺纖維化相關(guān)蛋白FN，α-SMA，Collagen I的表達(dá)水平從而起到抵抗肺纖維化的作用(P<0.01)，如圖2所示。這個(gè)結(jié)果與HE、Masson染色結(jié)果一致。兩者比較無(wú)顯著性差異。吡非尼酮與槲皮素在抑制Collagen III的表達(dá)方面均不明顯，與模型組比較無(wú)顯著差異。

圖1 染色結(jié)果(A為HE染色結(jié)果，B為Masson染色結(jié)果)

圖2 纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

2.3 IPF小鼠模型中S1P、SphK1的表達(dá)

研究結(jié)果顯示，博來(lái)霉素可顯著增加S1P、SphK1的表達(dá)水平，而吡非尼酮,與槲皮素均可顯著降低由博來(lái)霉素引起的肺組織中SphK1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的升高(P<0.01)，如圖3A、B所示；同時(shí)也可以顯著降低由博來(lái)霉素引起的血清和肺組織中S1P的表達(dá)水平的升高(P<0.01)，如圖3C、D所示。可見(jiàn)吡非尼酮與槲皮素對(duì)IPF小鼠模型中S1P、SphK1表達(dá)均具有一定的抑制作用，兩者比較無(wú)顯著性差異。

圖3 IPF小鼠模型中S1P、SPHK的表達(dá)量

3 討論

特發(fā)性肺纖維化是(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種慢性、進(jìn)行性、纖維化性間質(zhì)型肺病，其病理組織學(xué)改變與普通的間質(zhì)型肺炎相似，是特發(fā)性間質(zhì)性肺炎中最常見(jiàn)的類型[4]，但發(fā)病原因尚未完全闡明，目前也沒(méi)有有效的治療手段，且患病率和病死率成逐年上升的趨勢(shì)，故也成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一[5-6]。最近研究證明，IPF是由慢性的上皮細(xì)胞損傷，纖維細(xì)胞異常活躍造成的[7-12]。近年來(lái)Milara等[2]研究發(fā)現(xiàn)在IPF患者的血清和肺泡灌洗液中S1P水平升高，且這種S1P水平升高與肺功能呈負(fù)相關(guān)性；也發(fā)現(xiàn)在IPF患者肺組織中SphK1表達(dá)增加與α-SMA、波形蛋白及Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)增加相關(guān)。成纖維細(xì)胞主要表達(dá)S1P1、S1P2和S1P3。在S1P信號(hào)反應(yīng)中，S1P1介導(dǎo)細(xì)胞遷移和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞增殖；相反，S1P2介導(dǎo)抑制細(xì)胞遷移和EMFs及人肺成纖維細(xì)胞HLF1的增殖[2-3]。King等[13]研究也證實(shí)S1P通過(guò)自分泌TGF-β的方式誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞A549的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，TGF-β和S1P之間的交聯(lián)機(jī)制部分是依賴SphK1活性及S1P的產(chǎn)生。由于S1P具有類似于TGF-β的作用，S1P也可引起肺纖維細(xì)胞表達(dá)α平滑肌肌動(dòng)蛋白。S1P可使肺纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中發(fā)現(xiàn)，肺纖維化灶中出現(xiàn)高表達(dá)的SPHKl和α平滑肌肌動(dòng)蛋白，當(dāng)使用SphK抑制劑和siRNA基因敲除S1P2/SphK1或S1P3/SphK可降低TGF-β誘導(dǎo)的α-SMA、纖維連接蛋白和膠原蛋白的表達(dá)；以上研究結(jié)果表明S1P及其受體可能參與肺纖維化過(guò)程[14]。

2015年ATS/ERS/JRS/ALAT聯(lián)合發(fā)表的特發(fā)性肺纖維化國(guó)際指南中吡非尼酮成為IPF治療的新晉推薦藥物。吡非尼酮是口服的吡啶類藥物，能調(diào)節(jié)許多細(xì)胞因子，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、血小板衍生因子(PDGF)和腫瘤壞死因子(TNF-α)，改變膠原表達(dá)合成和累積，抑制細(xì)胞外基質(zhì)增殖和表達(dá)[3]，具有抗炎、抗氧化及抗纖維化的作用。吡非尼酮調(diào)節(jié)纖維增生的機(jī)制至今尚未完全清楚，其生物學(xué)活性可能是多靶點(diǎn)的。銀杏葉是一種中藥，在抑制呼吸道炎癥[15]、急性肺損傷修復(fù)[16]、肺癌惡性腫瘤抑制[17]等方面發(fā)揮作用。槲皮素是一種黃酮類化合物，存在于多種草藥中，包括銀杏葉[18]。已有報(bào)道槲皮素在動(dòng)物模型中抑制CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化、異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟纖維化和單側(cè)輸尿管梗阻性腎纖維化[19-21]。最近，有報(bào)道稱槲皮素可以減輕博萊霉素誘導(dǎo)的Wistar大鼠肺纖維化[22]，但其機(jī)制尚未闡明。本研究發(fā)現(xiàn)吡非尼酮與槲皮素抗肺纖維化作用與調(diào)節(jié)S1P/SPHK 信號(hào)通路有關(guān)，這可能是用于肺纖維化的臨床治療的原因。研究比較觀察了吡非尼酮與槲皮素干預(yù)S1P/SPHK 信號(hào)通路的作用結(jié)果，認(rèn)為兩種藥物在調(diào)節(jié)S1P/SPHK 信號(hào)通路方面未見(jiàn)明顯差異，提示可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究含槲皮素類藥物用于肺纖維化的臨床治療，未來(lái)研究可以進(jìn)一步觀察兩藥聯(lián)合使用對(duì)于肺纖維化的治療效果是否有協(xié)同作用。