郜珊珊，霍建華，王 晨，鄧伏雪，王麗君，強(qiáng) 華

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西西安 710061；2. 陜西省分子心臟病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710061；3. 環(huán)境與疾病相關(guān)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710061)

心肌炎(myocarditis, MC)是一種以心肌細(xì)胞壞死、變形及心肌間質(zhì)廣泛炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為主要特點(diǎn)的心肌疾患，也是擴(kuò)張型心肌病(dilatedcardio-myopathy, DCM)和猝死的常見(jiàn)原因，自身免疫反應(yīng)是其重要的病理機(jī)制[1]。自噬是細(xì)胞的“自我吞噬”，它是將壞死的蛋白質(zhì)、殘留的細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)的病毒及細(xì)菌病原體輸送到溶酶體并降解或者回收，使因此形成的大分子進(jìn)行再循環(huán)的一個(gè)過(guò)程。自噬已被證實(shí)在多種疾病的發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮保護(hù)性作用[2-3]，并且有研究顯示增強(qiáng)自噬活性能起到改善心臟功能的作用[4-5]。

姜黃素是從植物姜黃中提取而來(lái)，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向其抗炎亞型(M2型)分化、抑制心肌炎癥并改善自身免疫性心肌炎(experimental autoimmune myocarditis, EAM)大鼠心臟功能[7]。另有研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠通過(guò)促進(jìn)自噬和減輕細(xì)胞凋亡而預(yù)防糖尿病性心肌病的發(fā)生[8]。姜黃素能否通過(guò)誘導(dǎo)EAM大鼠心肌細(xì)胞的自噬活性從而改善其心功能，目前相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究以EAM大鼠為研究對(duì)象，觀察姜黃素干預(yù)后能否通過(guò)激活自噬活性改善模型大鼠心臟功能。

1 材料與方法

1.1 材料體質(zhì)量230～280 g的健康雄性Lewis大鼠，共21只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)用姜黃素、豬心肌肌球蛋白、弗氏佐劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；玉米油購(gòu)自中國(guó)長(zhǎng)壽花食品股份有限公司；兔抗大鼠LC3抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；GAPDH購(gòu)自中國(guó)Proteintech公司；抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Abbkine公司；其余常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；Real-time PCR引物序列均由上海捷瑞基因公司合成。免疫大鼠所用抗原佐劑乳化液由豬心肌肌球蛋白和弗氏完全佐劑乳化后獲得。

1.2 動(dòng)物模型建立與分組EAM大鼠模型的建立按照本課題組之前建立的造模方法進(jìn)行。將大鼠隨機(jī)分組(n=7)，即對(duì)照組(Con組)、模型組(EAM組)及姜黃素處理組(Cur組)。在實(shí)驗(yàn)第0天和第7天時(shí)，于大鼠左右后足墊處皮下注射弗氏完全佐劑(Con組)或抗原佐劑乳化液(EAM組和Cur組)各0.1 mL，并以等量玉米油(Con組和EAM組)或姜黃素50 mg/(kg·d)(Cur組)灌胃。灌胃干預(yù)21 d。大鼠飼養(yǎng)在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，給予普通SPF級(jí)無(wú)菌飼料喂養(yǎng)直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，期間不限制大鼠攝食及飲水[9]。

1.3 心動(dòng)超聲檢查實(shí)驗(yàn)第22天(干預(yù)結(jié)束后次日)，用90 mg/kg氯胺酮+10 mg/kg甲苯噻嗪混合溶液腹腔注射麻醉大鼠，使用PHILIPS B型超聲診斷儀(iE33)行心動(dòng)超聲檢查，檢測(cè)如下指標(biāo)：心率(heart rate, HR)、射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction, EF)、左室收縮末內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter, LVEDs)、左室舒張末內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter, LVEDd)、室間隔厚度(left ventricular diastolic interventricular septum thickness, LVS)、左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening, LVFS)、左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness, LVPW)；各項(xiàng)測(cè)量值均選取5個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期采樣后獲得的平均值。

1.4 Western blot檢測(cè)行心動(dòng)超聲檢查后，處死大鼠并獲取心肌組織。從大鼠心肌組織中提取蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)。一抗選用兔抗大鼠LC3抗體，稀釋比為1∶1 000；二抗選用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記山羊抗兔抗體，稀釋比為1∶2 000，使用GAPDH作為內(nèi)參，稀釋度為1∶5 000。運(yùn)用Image-Pro Plus 5.0圖像分析軟件測(cè)定條帶的灰度值。

1.5 Real-time PCR檢測(cè)從大鼠心肌組織中提取總RNA，使用Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GUSB為內(nèi)參，采用SYBR Green熒光嵌合法，檢測(cè)Beclin-1/ATG-5基因mRNA表達(dá)。各引物序列見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR各基因的引物序列

Tab.1 Sequences of Real-time PCR primers of genes

基因引物序列(5'-3')GUSB上游CTCTGGTGGCCTTACCTGAT下游CAGACTCAGGTGTTGTCATCGBeclin-1上游GTTCTGCGGTTCTACTGT下游ATAATCGTGTTCAAATCAATG-5上游TTTGACGCTGGTAACTGACAAAGTG下游CAAGGCAGAGCTGAGCTTGATG

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素改善EAM大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能姜黃素干預(yù)21 d后，第22天(即干預(yù)后次日)將大鼠麻醉后進(jìn)行心動(dòng)超聲檢查的結(jié)果顯示：與Con組相比，EAM組大鼠HR明顯增快(P<0.001)；給予姜黃素50 mg/(kg·d)灌胃處理后，Cur組大鼠HR較EAM組減慢(P=0.001)。EAM組大鼠心臟EF較Con組明顯降低(P<0.001)；姜黃素灌胃后，EAM大鼠EF升高并恢復(fù)至對(duì)照組水平(P<0.001)。EAM組大鼠LVEDs明顯增加，而LVFS明顯降低，提示EAM組大鼠存在左室收縮功能異常；給予姜黃素處理后，Cur組大鼠LVEDs明顯減小(P=0.030)，LVFS升高(P=0.019)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這提示EAM大鼠左室收縮功能發(fā)生障礙，且該心功能障礙可被姜黃素逆轉(zhuǎn)(表2)。

表2 各組大鼠心臟超聲結(jié)果及血液動(dòng)力學(xué)改變

Tab.2 Echocardiographic and hemodynamic parameters in each group of rats

指標(biāo)Con(n=7)EAM(n=7)Cur(n=7)FPHR(次/min)447.30±10.22540.17±12.25**477.09±14.20##89.19<0.001EF(%)80.01±2.7871.99±1.90**81.42±2.00##30.28<0.001LVEDs(mm)2.77±0.283.78±1.01*2.87±0.14##5.680.012LVEDd(mm)5.99±0.396.02±0.475.56±0.252.490.110LVFS(%)47.81±3.9142.34±6.79**46.57±2.77#7.600.004LVPW(mm)0.99±0.061.07±0.031.12±0.031.780.195

Con：對(duì)照組；EAM：心肌炎模型組；Cur：姜黃素干預(yù)組；HR：心率；EF：射血分?jǐn)?shù)；LVEDs：左室收縮末內(nèi)徑；LVEDd：左室舒張末內(nèi)徑；LVFS：左室短軸縮短率；LVPW：左室后壁厚度；數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；與Con組比較，*P<0.05，**P<0.01；與EAM組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.2 姜黃素促進(jìn)EAM大鼠心肌LC3的表達(dá)LC3是自噬體發(fā)揮功能的相關(guān)蛋白，其表達(dá)水平的高低能夠反映心肌自噬活性的變化。本實(shí)驗(yàn)各組間LC3蛋白表達(dá)有差異(F=20.43，P=0.001，圖1)，EAM組大鼠LC3的表達(dá)高于Con組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026)；而給予姜黃素處理后，LC3表達(dá)較EAM組進(jìn)一步顯著升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.014)。

2.3 心肌Beclin-1的表達(dá)情況Beclin-1和 ATG-5均為L(zhǎng)C3的上游基因，是參與自噬調(diào)控的關(guān)鍵因子。Real-time PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示：各組間Beclin-1表達(dá)有差異(F=29.38，P=0.001)，EAM大鼠心肌組織內(nèi)的表達(dá)較Con組升高(P=0.041)；給予姜黃素干預(yù)后，Cur組大鼠心肌組織內(nèi)Beclin-1表達(dá)較EAM組進(jìn)一步升高(P=0.003)，而ATG-5表達(dá)雖在EAM組及Cur組大鼠中表現(xiàn)出升高趨勢(shì)，但并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.877，P=0.108，圖2)。提示姜黃素促進(jìn)EAM大鼠心肌Beclin-1表達(dá)，對(duì)ATG-5基因表達(dá)無(wú)明顯作用。

圖1 姜黃素對(duì)大鼠心肌細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)的影響

Fig.1 Effect of curcumin on the protein expression of LC3 in the myocardium of EAM rats (n=7)

與Con組比較，*P<0.05，**P<0.01；與EAM組比較，#P<0.05。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)以Lewis大鼠為研究對(duì)象，通過(guò)足墊注射豬心肌肌球蛋白構(gòu)建EAM模型，給予姜黃素灌胃處理后，觀察大鼠心臟功能及心肌細(xì)胞自噬活性的變化。結(jié)果顯示，EAM組大鼠出現(xiàn)左室收縮功能異常及心臟EF降低，同時(shí)心肌自噬活性較Con組大鼠升高，與HU等[10]的報(bào)道一致；給予50 mg/(kg·d)的姜黃素干預(yù)21 d后，不僅心肌炎大鼠左室收縮功能及心臟EF得到改善，并且心肌細(xì)胞自噬活性較對(duì)照組及模型組顯著升高，通過(guò)進(jìn)一步探究自噬上游基因表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠促進(jìn)自噬調(diào)控基因Beclin-1 mRNA表達(dá)。

圖2 姜黃素對(duì)EAM大鼠心肌細(xì)胞LC3上游因子表達(dá)的影響

Fig.2 Effect of curcumin on the expression of LC3 up-stream factors in the myocardium of EAM rats

與Con組比較，*P<0.05，**P<0.01；與EAM組比較，##P<0.01。

自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種程序性細(xì)胞死亡機(jī)制。細(xì)胞通過(guò)自噬作用能夠完成對(duì)胞內(nèi)衰老的蛋白質(zhì)及受損的細(xì)胞器重新加工再利用，并為自身提供能量以維持細(xì)胞正常代謝、更新細(xì)胞器及保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。LC3是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的自噬體標(biāo)記蛋白，其表達(dá)水平高低能夠反映體內(nèi)自噬活性的強(qiáng)弱。Beclin-1是最早發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物自噬調(diào)控基因，是自噬體早期形成調(diào)控的關(guān)鍵因子。ATG-5在自噬體形成階段與ATG-12及ATG-16形成多聚體后作用于自噬前體，參與自噬體的延伸。自噬在基礎(chǔ)條件下呈現(xiàn)出低水平活性，能夠調(diào)控衰老死亡的蛋白質(zhì)或受損細(xì)胞器的再利用，發(fā)揮著細(xì)胞管家的作用[2-3]。既往多項(xiàng)研究證實(shí)，自噬活性增強(qiáng)能夠改善心臟功能。GU[4]以心肌梗死后發(fā)生糖尿病的大鼠為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)西格列汀可通過(guò)激活自噬并抑制心肌梗死后糖尿病的炎癥反應(yīng)從而改善大鼠的心臟功能并降低其死亡率。WANG[5]發(fā)現(xiàn)環(huán)絲氨酸通過(guò)促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬和抑制MMP-2和MMP-9表達(dá)，改善心臟功能障礙。

研究發(fā)現(xiàn)，Th-1相關(guān)細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-1β等，能夠誘導(dǎo)自噬發(fā)生；而IL-4和IL-10等Th2相關(guān)細(xì)胞因子則能夠抑制自噬的表達(dá)[11]。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，心肌炎大鼠心肌細(xì)胞中炎癥因子IL-1β的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高[7]，提示EAM大鼠機(jī)體內(nèi)的高炎癥狀態(tài)可能促進(jìn)自噬表達(dá)。但EAM組大鼠的心功能較對(duì)照組惡化，提示此時(shí)自噬活性的增強(qiáng)雖有可能起到一定的心肌保護(hù)作用，尚未達(dá)到能夠顯著改善心臟功能的活性狀態(tài)。

已有研究發(fā)現(xiàn)，不同的病理生理?xiàng)l件下和疾病過(guò)程中，姜黃素對(duì)自噬的調(diào)節(jié)作用有可能不同。體外研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠通過(guò)抑制PI3K、促進(jìn)Beclin-1和Bcl-2的解離，增加細(xì)胞質(zhì)中游離的Beclin-1，以及干擾FOXO1的核定位而發(fā)揮其誘導(dǎo)自噬的作用[12]。LIU[13]的研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過(guò)誘導(dǎo)自噬及凋亡抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖與活化從而起到抗腫瘤作用。HUANG[14]發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠通過(guò)抑制自噬改善實(shí)驗(yàn)大鼠腦部的缺血再灌注損傷。然而，本研究中給予姜黃素干預(yù)后，心肌炎大鼠心肌自噬活性較EAM組進(jìn)一步增強(qiáng)，并且此時(shí)心肌炎大鼠心功能得到明顯改善，提示姜黃素能夠通過(guò)誘導(dǎo)自噬發(fā)揮其心肌保護(hù)作用。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建大鼠EAM模型，心動(dòng)超聲檢測(cè)發(fā)現(xiàn)心肌炎大鼠心臟收縮功能減弱，EF降低，心肌細(xì)胞自噬活性反應(yīng)性增強(qiáng)；姜黃素干預(yù)后，心肌炎大鼠心肌細(xì)胞自噬活性進(jìn)一步增強(qiáng)，大鼠心臟收縮功能改善，EF升高，提示姜黃素能夠通過(guò)增強(qiáng)自噬活性改善EAM大鼠心功能，并且該作用是通過(guò)誘導(dǎo)LC3上游分子Beclin-1表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。本研究為姜黃素的心肌保護(hù)作用增添了新的證據(jù)，但其通過(guò)何種機(jī)制增強(qiáng)自噬活性，需要后續(xù)的深入研究。